Gennemførelse af et ikke-lineært mikroskop baseret på stimuleret Raman spredning
Summary
I dette manuskript beskrives gennemførelsen af et stimuleret Raman spredning (SRS)-mikroskop, som opnås ved integrationen af en SRS-eksperimentel opsætning med et mikroskop til Laserscanning. SRS-mikroskop er baseret på to at (FS) laser kilder, en ti-safir (ti: SA) og synkroniseret optisk parametrisk oscillator (OPO).
Abstract
Stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi bruger nær-infrarød excitation lys; Derfor, det deler mange multi-photon mikroskopiske billeddannelse egenskaber. SRS Imaging modalitet kan fås ved hjælp af kommercielle laser-scanning mikroskoper ved at udstyre med en ikke-nedsænket fremad detektor med ordentlig båndpas filtre og lock-in forstærker (Lia) afsløring ordning. Et skematisk layout af et typisk SRS-mikroskop omfatter følgende: to pulserende laserstråler (dvs. pumpen og sonden, der er rettet ind i et scannings mikroskop), som skal overlappes i både rum og tid på billedplanet, og som derefter fokuserer på et mikroskop-mål i prøven gennem to scannings spejle (SMs), som raster brændpunktet på tværs af et x-y-plan. Efter interaktion med prøven opsamles de transmitterede output impulser af en øvre målsætning og måles ved et fremad detekteringssystem indsat i et inverteret mikroskop. Pumpe impulser fjernes af en stak optiske filtre, hvorimod sonde impulserne, der er resultatet af SRS-processen i enhedens brændvidde, måles ved hjælp af en fotodiode (PD). Udlæningen af PD er demodulerede af Lia at udtrække modulations dybden. Der opnås et todimensionalt (2D) billede ved at synkronisere enheden til fremad sporing med mikroskop scanningsenheden. I dette dokument er implementeringen af et SRS-mikroskop beskrevet og med succes demonstreret, samt rapportering af etiket frie billeder af polystyren perler med diametre på 3 μm. Det er værd at bemærke, at SRS mikroskoper ikke er kommercielt tilgængelige, så for at drage fordel af disse egenskaber, den hjemmelavede konstruktion er den eneste mulighed. Da SRS mikroskopi er ved at blive populær i mange områder, det menes, at denne omhyggelige beskrivelse af SRS mikroskop gennemførelse kan være meget nyttigt for det videnskabelige samfund.
Introduction
I Life Science-applikationer er SRS-mikroskopi dukket op som et effektivt værktøj til Label-fri billeddannelse. Den grundlæggende idé om SRS mikroskopi er at kombinere styrken af vibrationelle kontrast og dens evne til at erhverve billeder i et par sekunder.
SRS er en proces, hvor frekvensen forskellen mellem to laserstråler frekvenser (pumpe signal og Stokes signal ved forskellige frekvenser) svarer til den molekylære vibration af en undersøgt prøve, forårsager stimuleret Raman spredning og en signifikant stigning i Stokes signalet. I modsætning til lineær Raman spektroskopi udviser SRS en ikke-lineær afhængighed af de indkommende lysfelter og producerer sammenhængende stråling. SRS har to grundlæggende fordele: 1) hastighed, som gør billeder mindre følsomme over for artefakter som følge af prøve bevægelse eller nedbrydning, og 2) et fremragende signal-støj-forhold (SNR). Derudover udviser SRS et spektrum, der er identisk med den spontane Raman, og SRS-signalet er lineært proportionalt med koncentrationen af den kemiske binding, der er spændt1,2,3,4, 5.
I vores mikroskop er en at (FS) SRS-eksperimentel opsætning integreret med et inverteret optisk mikroskop udstyret med en hurtig spejle scanningsenhed (figur 1)6,7,8. To pulserende laser kilder bruges til at implementere dette mikroskop. Den første er en FS-ti: SA med en puls varighed på ca. 140 FS, gentagelsesfrekvens på 80 MHz og emissions bølgelængder i intervallet 680-1080 nm. Den anden, der anvendes som sonde stråle og pumpet af ti: SA, er en at synkroniseret optisk parametrisk oscillator (Sopo), med en impuls varighed på ca. 200 FS, gentagelseshastighed på 80 MHz, og emissions bølgelængder i intervallet 1000-1600 nm. Det skal bemærkes, at den mindste foton energi forskel mellem ti: SA og SOPO stråle er 2500 cm-1. Derfor, ved hjælp af denne kombination af laser systemer, kun højfrekvens C-H region (2800-3200 cm-1) af Raman Spectra kan udforskes6,7,8.
For at oprette et SRS-mikroskop er der tre afgørende spørgsmål at overveje, som er beskrevet i de efterfølgende afsnit. Den første er gennemførelsen af en højfrekvent modulations overførselsmetode (Se figur 2 og trin 2,1 i protokollen for en beskrivelse). I en SRS eksperimentel undersøgelse, en afgørende parameter er følsomheden af systemet. Et SRS-signal detekteres som en lille ændring i intensiteten af excitation bjælker; Derfor kan det være ødelagt af laser intensitet støj og skudt støj. Dette problem kan løses ved at integrere dette system med en højfrekvens modulations overførselsmetode (Se figur 2 og trin 2,1 i protokollen for detaljer). I denne metode anvendes en elektrooptisk modulator (EOM) til at moduere pumpen. Den modulering, der overføres til sonde strålen, kan derefter detekteres af en PD efter blokering af pumpe strålen med en stak optiske filtre [stimuleret Raman Gain (SRG) detekterings tilstand]. PD-udgangen er forbundet med et lavpasfilter til en lock-in forstærker (LIA), som demodulerer det målte signal. Ved at øge modulens modulationsfrekvens til frekvenser over 1 MHz kan den iboende grænse for PDs opnås.
Det andet spørgsmål at overveje, er installationen af en mekanisk beslag, som tillader at udføre fremadrettet detektion og samtidig at bevare mikroskop observation i brightfield. Desuden skal det reducere støjen på grund af mekaniske vibrationer under genereringen af billeder og for at muliggøre en præcis Repositionering af detekterings systemet (Se figur 3 og trin 2,2 i protokollen).
Det tredje er synkroniseringen af det signal, der er erhvervet af den fase følsomme detekterings ordning, hvor strålen er anbragt på prøven, som overvåges af mikroskopets scannings hoved. For at realisere billeder, SMS kræver tre TTL-signaler, der er stillet til rådighed af mikroskop controller tilsluttet til Scan hovedenhed: pixel ur, linje Sync, og ramme Sync. Synkroniseringen opnås ved at kontrollere ved hjælp af et PCI-kort, de tre TTL-signaler, og erhvervelse af et spændingssignal på udgangs kanalen af Lia6,7,8. En hjemmelavet software er blevet udviklet og beskrevet tidligere6,7,8, mens hardwaren i synkroniserings systemet er rapporteret i figur 4.
En grundlæggende procedure ved udførelse af SRS-afbildning er mikroskop justering. Det er realiseret i løbet af fire trin, som er beskrevet i de efterfølgende afsnit. Den første er den rumlige overlapning af to bjælker (Se trin 3,1 i protokollen). I dette eksperimentelle set-up, de to bjælker var rumligt collinearly kombineret med en koldtlysreflektorlamper spejl. Det indledende skridt er tilpasningen af OPO og ti: SA, så hver når mikroskop. Derefter, overvejer OPO som en referencestråle og drage fordel af en position følsom detektor, ti: SA er rumligt overlappet til OPO.
Det andet afgørende aspekt er den tidsmæssige overlapning af to bjælker (Se trin 3,2 i protokollen). Selv om pumpen og OPO bjælker er perfekt synkroniseret9, da de følger lidt forskellige stråle stier inde i OPO huset, ved OPO exit de har en tidsforsinkelse på omkring 5 ns og rumlig forskel på 5 cm. Derfor kræver ti: SA og OPO, at de bliver gentimet optisk for at sikre tidsmæssig overlapning ved stikprøven. Dette opnås typisk med en fint tunbar optisk forsinkelses linje, som i dette tilfælde indsættes mellem ti: SA og mikroskopet (Se figur 1). For at opnå den tidsmæssige overlapning af to bjælker, anvendes to teknikker. Den første udføres ved hjælp af en hurtig PD og Oscilloscope, mens den anden er baseret på Auto-og tvær optiske korrelationer. Ved hjælp af den første teknik opnås en grov overlapning af to stråler (usikkerhed på 10 PS), mens en nøjagtig tidsmæssig overlapning af to bjælker opnås ved hjælp af en kryds korrelator (opløsning på 1 FS).
Det tredje afgørende aspekt er tilpasningen af de to bjælker i mikroskop (Se trin 3,3 i protokollen). En foreløbig hvid lys observation af prøven gør det muligt at individuere det ønskede synsfelt (FOV). Bagefter justeres laserstråler, der kommer ind i mikroskopet med en side port af mikroskop, for at nå PD monteret på den øverste del (figur 3). Hvis du ønsker en korrekt billed anskaffelse, er det dog nødvendigt at angive et antal parametre (f. eks. pixeldimension og pixel opholdstid). Prøvetagnings frekvensen skal respektere begrænsningen pålagt af Nyquists sætning for at bevare alle oplysninger i et billede, mens integrationstiden for en korrekt korrespondance mellem pixels og SRS-værdi målt i hver pixel er af LIA skal være lig med eller sammenlignelig med pixel opholdstid.
I det sidste trin af mikroskop tilpasningen udføres talrige tests for at optimere den rumlige og tidsmæssige tilpasning (Se trin 3,4 i protokollen). En række transmission images (TI) for både ti: SA og OPO er erhvervet for at optimere rumlig overlapning. I en TI anvendes en enkelt stråle, og den transmitterede stråle intensitet fra prøven måles ved hjælp af en PD. I tilfælde af TI realiseret af OPO, PD udgangssignalet er direkte forbundet til PCI-kort, mens der i tilfælde af TI realiseret af ti: SA, PD udgangssignalet er forbundet til LIA og analog udgang af LIA er forbundet til PCI-kort. Transmissions billederne er meget nyttige til at optimere FOV, belysningen, brændpositionen af mikroskopet mål og til at kontrollere, om de to bjælker er rumligt overlappet6,7,8.
Optimering af pumpen og Probe strålens tidsmæssige overlap opnås ved at scanne forsinkelses linjen med trin på 0,001 mm svarende til en 3,3 FS Time-Shift og udføre en SRS-måling i et enkelt punkt af en polystyren perle prøve 3 μm i diameter. Amplituden på et SRS-Signalmåler værdier fra Lia, som en funktion af sonde-pumpe forsinkelsen, og giver et maksimum svarende til den nøjagtige tidsmæssige overlapning af de to bjælker6,7,8. Før du afslutter, skal det bemærkes, at alle diskuterede trin er obligatoriske for at opnå en høj kvalitet billede.
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS mikroskopi har taget label-fri billeddannelse til nye højder, især i undersøgelser af komplekse biologiske strukturer som lipider, som er grundlæggende for celler og cellulære arkitektur. Lipider er involveret i flere fysiologiske veje såsom produktion af biologiske membraner, og de tjener som biosyntetiske prækursorer og signal transducere10. Lipider er pakket ind i specialiserede intracellulære organelles, også kaldet lipid dråber (LDs). Deres diametre varierer fra få titusinder a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter pris på V. Tufano fra IMM CNR for hans værdifulde tekniske assistance og Giacomo Cozzi, produktspecialist fra Nikon Instruments, for nyttige diskussioner og kontinuerlig support. Dette arbejde blev delvis støttet af italienske nationale operative programmer PONa3 00025 (BIOforIU) og af euro-bioimaging storstilet paneuropæisk forskningsinfrastruktur projekt.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
Referências
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
