Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing
Summary
In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).
Abstract
Gestimuleerd Raman verstrooiing (SRS) microscopie maakt gebruik van near-infrarood excitatie licht; Daarom deelt het veel multi-photon microscopische Imaging-eigenschappen. SRS Imaging modaliteit kan worden verkregen met behulp van commerciële laserscannende microscopen door het uitrusten met een niet-gedescande voorwaartse detector met de juiste band pass-filters en het detectie schema van de lock-in versterker (LIA). Een schematische lay-out van een typische SRS-Microscoop omvat de volgende: twee gepulseerde laserstralen, (d.w.z. de pomp en sonde in een scan Microscoop), die moet worden overlapt in zowel ruimte en tijd op het beeldvlak, vervolgens gericht door een Microscoop doelstelling in het monster door twee scan spiegels (SMs), die de brandpunt in een x-y-vlak raster. Na interactie met het monster worden verzonden uitgangs pulsen opgevangen door een bovenobjectief en gemeten door een voorwaartse detectiesysteem dat in een omgekeerde Microscoop is ingebracht. Pomp pulsen worden verwijderd door een stapel optische filters, terwijl de sonde pulsen die het resultaat zijn van het SRS-proces dat zich voordoet in het brand volume van het preparaat, worden gemeten met een fotodiode (PD). De aflezen van de PD wordt door de LIA gedemoduleerd om de Modulatiediepte te extraheren. Een tweedimensionale (2D) afbeelding wordt verkregen door de voorwaartse detectie-eenheid te synchroniseren met de Microscoop Scaneenheid. In dit document wordt de implementatie van een SRS-Microscoop beschreven en met succes gedemonstreerd, evenals de rapportage van etiketten vrije beelden van polystyreen kralen met diameters van 3 μm. Het is vermeldenswaard dat SRS microscopen zijn niet commercieel beschikbaar, dus om te profiteren van deze kenmerken, de zelfgemaakte constructie is de enige optie. Aangezien SRS microscopie populair wordt op veel gebieden, wordt aangenomen dat deze zorgvuldige beschrijving van de implementatie van de SRS-Microscoop zeer nuttig kan zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.
Introduction
In Life Science-toepassingen is SRS microscopie een krachtig hulpmiddel voor label vrije beeldvorming. Het basisidee van SRS microscopie is het combineren van de sterkte van trillational contrast en de mogelijkheid om beelden te verwerven in een paar seconden.
SRS is een proces waarbij het frequentieverschil tussen twee laserstralen frequenties (pomp signaal en Stokes signaal op verschillende frequenties) overeenkomt met de moleculaire trilling van een onderzocht monster, waardoor gestimuleerd Raman verstrooiing en een aanzienlijke verhoging van het Stokes signaal. In tegenstelling tot lineaire Raman-spectroscopie vertoont SRS een niet-lineaire afhankelijkheid van de binnenkomende licht velden en produceert het samenhangende straling. SRS heeft twee fundamentele voordelen: 1) snelheid, waardoor afbeeldingen minder gevoelig zijn voor artefacten die voortvloeien uit monster beweging of degradatie, en 2) een uitstekende signaal-ruis verhouding (SRV). Bovendien vertoont SRS een spectrum dat identiek is aan de spontane Raman, en het SRS-signaal is lineair evenredig aan de concentratie van de chemische obligatie die opgewonden is1,2,3,4, 5.
In onze Microscoop is een femtosecondelaser (FS) SRS experimentele set-up geïntegreerd met een omgekeerde optische Microscoop uitgerust met een snelle spiegels Scanning Unit (Figuur 1)6,7,8. Twee gepulseerde laserbronnen worden gebruikt om deze Microscoop te implementeren. De eerste is een FS-TI: SA met een puls duur van ongeveer 140 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 680-1080 nm. De tweede, gebruikt als sonde straal en gepompt door TI: SA, is een femtosecondelaser gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (SOPO), met een puls duur van ongeveer 200 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 1000-1600 nm. Opgemerkt moet worden dat de minimale foton energieverschil tussen de TI: SA en Sopo Beam is 2500 cm-1. Daarom, met behulp van deze combinatie van lasersystemen, kan alleen de hoge frequentie C-H regio (2800-3200 cm-1) Raman spectra worden verkend6,7,8.
Om een SRS-Microscoop op te zetten, zijn er drie cruciale punten die in de opeenvolgende paragrafen worden beschreven. De eerste is de implementatie van een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor een beschrijving). In een SRS-experimenteel onderzoek is een cruciale parameter de gevoeligheid van het systeem. Een SRS-signaal wordt gedetecteerd als een kleine verandering in de intensiteit van excitatie balken; Daarom kan het worden beschadigd door laserintensiteit ruis en schot ruis. Dit probleem kan worden overwonnen door de integratie van dit systeem met een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor meer informatie). Bij deze methode wordt een elektro-optische modulator (EOM) gebruikt om de pomp te moduleren. De modulatie overgebracht naar de sonde straal kan vervolgens worden gedetecteerd door een PD na het blokkeren van de pomp balk met een stapel optische filters [gestimuleerd Raman Gain (SRG) detectiemodus]. De PD-uitgang wordt met een low pass-filter verbonden aan een lock-in versterker (LIA), die het gemeten signaal demoduleert. Door de modulatie frequentie van de straal naar frequenties boven 1 MHz te verhogen, kan de intrinsieke limiet van PDs worden verkregen.
Het tweede punt dat u moet overwegen is de installatie van een mechanische steun die het mogelijk maakt om voorwaartse detectie uit te voeren en tegelijkertijd de observatie van de Microscoop in brightfield te behouden. Daarnaast moet het geluid verminderen door mechanische trillingen tijdens het genereren van beelden en om de precieze herpositionering van het detectiesysteem mogelijk te maken (Zie Figuur 3 en stap 2,2 van het Protocol).
De derde is de synchronisatie van het signaal dat door het fase gevoelige detectie schema wordt verkregen, waarbij de straal op het monster wordt geplaatst dat door de scan kop van de Microscoop wordt bewaakt. Om afbeeldingen te realiseren, hebben de SMs drie TTL-signalen nodig die beschikbaar worden gesteld door de Microscoop-controller die is aangesloten op de scan hoofdeenheid: pixel klok, lijn synchronisatie en frame synchronisatie. De synchronisatie wordt bereikt door het besturen van een PCI-kaart, de drie TTL-signalen en het verkrijgen van een spanningssignaal op het uitgangskanaal van Lia6,7,8. Een zelfgemaakte software is ontwikkeld en beschreven eerder6,7,8, terwijl de hardware van het synchronisatie systeem wordt gerapporteerd in Figuur 4.
Een fundamentele procedure bij het uitvoeren van SRS Imaging is Microscoop uitlijning. Het wordt gerealiseerd in de loop van vier stappen, die in de opeenvolgende alinea’s worden beschreven. De eerste is de ruimtelijke overlapping van twee stralen (zie stap 3,1 van het Protocol). In deze experimentele opstelling, de twee balken waren ruimtelijk collinearly gecombineerd door een dichroïde spiegel. De voorbereidende stap is de uitlijning van OPO en TI: sa zodat elk de Microscoop bereikt. Dan, gezien OPO als een referentie straal en gebruik te maken van een positie gevoelige detector, de TI: SA is ruimtelijk overlapt naar OPO.
Het tweede cruciale aspect is de temporele overlapping van twee stralen (zie stap 3,2 van het Protocol). Zelfs als de pomp en OPO balken zijn perfect gesynchroniseerd9, omdat ze iets verschillende straal paden in de OPO behuizing volgen, bij de OPO exit hebben ze een tijdvertraging van ongeveer 5 NS en ruimtelijke verschil van 5 cm. Daarom moeten TI: SA en OPO worden opnieuw getimede met optisch om te zorgen voor tijdelijke overlapping op het voorbeeld. Dit wordt meestal bereikt met een fijnaftunable optische vertragings lijn, die in dit geval tussen de TI: SA en Microscoop wordt ingebracht (Zie Figuur 1). Om de temporele overlap van twee stralen te verkrijgen, worden twee technieken gebruikt. De eerste wordt uitgevoerd met behulp van een snelle PD en oscilloscoop, terwijl de tweede is gebaseerd op auto-en cross-optische correlaties. Met behulp van de eerste techniek wordt een ruwe overlapping van twee stralen verkregen (onzekerheid van 10 PS), terwijl een nauwkeurige temporele overlap van twee stralen wordt verkregen met behulp van een kruis correlator (resolutie van 1 FS).
Het derde cruciale aspect is de uitlijning van de twee stralen in de Microscoop (zie stap 3,3 van het Protocol). Een voorlopige witte licht observatie van het monster maakt het mogelijk om het gewenste gezichtsveld (FOV) te individueren. Daarna worden laserstralen, die de Microscoop door een zijpoort van de Microscoop binnenkomen, uitgelijnd om de PD te bereiken die op het bovenste deel is gemonteerd (Figuur 3). Voor een correcte beeld verwerving is het instellen van een aantal parameters echter vereist (bijvoorbeeld pixeldimensie en pixel dwelltijd). De bemonsteringsfrequentie moet de door de stelling van Nyquist opgelegde beperking respecteren om alle informatie in een afbeelding te behouden, terwijl voor een juiste correspondentie tussen de ruimtelijke coördinaten van pixels en SRS-waarde, gemeten in elke pixel, de integratie tijd van LIA moet gelijk zijn aan of vergelijkbaar zijn met de pixel dwelltijd.
In de laatste stap van de Microscoop-uitlijning worden tal van tests uitgevoerd om de ruimtelijke en temporele uitlijning te optimaliseren (zie stap 3,4 van het Protocol). Een aantal transmissie beelden (TI) voor zowel TI: SA en OPO worden verworven om de ruimtelijke overlap te optimaliseren. In een TI wordt een enkele straal gebruikt, en de uitgezonden straal intensiteit van het monster wordt gemeten door een PD. In het geval van TI gerealiseerd door OPO, het PD-uitgangssignaal is direct verbonden met PCI-kaart, terwijl in het geval van TI gerealiseerd door TI: SA, het PD-uitgangssignaal is aangesloten op LIA en analoge uitgang van LIA is aangesloten op PCI-kaart. De transmissie beelden zijn zeer nuttig voor het optimaliseren van de FOV, de verlichting, de focale positie van de Microscoop doelstellingen en om te controleren of de twee stralen ruimtelijk overlapt6,7,8.
De optimalisering van de tijds overlap van de pomp en de sonde straal wordt verkregen door het scannen van de vertragings lijn met stappen van 0,001 mm overeenkomend met een 3,3 FS tijdverschuiving en het uitvoeren van een SRS-meting in één punt van een polystyreen kraal monster 3 μm in diameter. De amplitude van een SRS-signaal meetwaarden van Lia, als een functie van de sonde-pomp vertraging, en biedt een maximum overeenkomend met exacte temporele overlapping van de twee stralen6,7,8. Voordat u afsluit, moet worden opgemerkt dat alle besproken stappen verplicht zijn om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS microscopie heeft label-vrije beeldvorming naar nieuwe hoogten, vooral in studies van complexe biologische structuren zoals lipiden, die fundamenteel zijn voor cellen en cellulaire architectuur. Lipiden zijn betrokken bij meerdere fysiologische trajecten zoals productie van biologische membranen, en ze dienen als biosynthetische precursoren en signaal transducers10. Lipiden zijn verpakt in gespecialiseerde intracellulaire organellen, ook wel lipide druppeltjes (LDs). Hun diameters variëren va…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij waarderen V. Tufano van IMM CNR voor zijn waardevolle technische assistentie en Giacomo Cozzi, product specialist van Nikon Instruments, voor nuttige discussies en voortdurende ondersteuning. Dit werk werd deels gesteund door Italiaanse nationale operatieve Programma’s PONa3 00025 (BIOforIU) en door euro-Bioimaging grootschalig panEuropean onderzoeksinfrastructuurproject.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
Referências
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
