Mise en œuvre d'un microscope non linéaire basé sur la diffusion stimulée de Raman
Summary
Dans ce manuscrit, la mise en œuvre d’un microscope à diffusion Raman (SRS) stimulé, obtenue par l’intégration d’un sER expérimental avec un microscope à balayage laser, est décrite. Le microscope SRS est basé sur deux sources laser femtoseconde (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) et un oscillateur paramétrique optique synchronisé (OPO).
Abstract
La microscopie de diffusion Raman stimulée (SRS) utilise la lumière d’excitation proche infrarouge; par conséquent, il partage de nombreuses propriétés d’imagerie microscopique multiphoton. La modalité d’imagerie SRS peut être obtenue à l’aide de microscopes à balayage laser commerciaux en équipant d’un détecteur avant non descanné avec des filtres de bande passet appropriés et un système de détection des amplificateurs de verrouillage (LIA). Une disposition schématique d’un microscope SRS typique comprend ce qui suit : deux faisceaux laser pulsés (c.-à-d., la pompe et la sonde dirigées dans un microscope à balayage), qui doivent être superposés dans l’espace et le temps au plan d’image, puis concentrés par un objectif de microscope dans l’échantillon à travers deux miroirs de balayage (SM), qui ratins la tache focale à travers un plan x-y. Après interaction avec l’échantillon, les impulsions de sortie transmises sont recueillies par un objectif supérieur et mesurées par un système de détection vers l’avant inséré dans un microscope inversé. Les impulsions de pompe sont enlevées par une pile de filtres optiques, tandis que les impulsions de sonde qui sont le résultat du processus de SRS se produisant dans le volume focal du spécimen sont mesurées par un photodiode (PD). La lecture de la DP est démoduée par la LIA pour extraire la profondeur de modulation. Une image bidimensionnelle (2D) est obtenue en synchronisant l’unité de détection avant avec l’unité de balayage au microscope. Dans cet article, la mise en œuvre d’un microscope SRS est décrite et démontrée avec succès, ainsi que la déclaration d’images sans étiquette de perles de polystyrène d’un diamètre de 3 m. Il est à noter que les microscopes SRS ne sont pas disponibles dans le commerce, donc afin de profiter de ces caractéristiques, la construction maison est la seule option. Étant donné que la microscopie SRS est de plus en plus populaire dans de nombreux domaines, on croit que cette description minutieuse de la mise en œuvre du microscope SRS peut être très utile pour la communauté scientifique.
Introduction
Dans les applications des sciences de la vie, la microscopie SRS est devenue un outil puissant pour l’imagerie sans étiquette. L’idée de base de la microscopie SRS est de combiner la force du contraste vibratoire et sa capacité à acquérir des images en quelques secondes.
SRS est un processus dans lequel la différence de fréquence entre deux fréquences de faisceaux laser (signal de pompe et signaux de stokes à différentes fréquences) correspond à la vibration moléculaire d’un échantillon étudié, provoquant une diffusion raman stimulée et une augmentation du signal Stokes. Contrairement à la spectroscopie linéaire de Raman, SRS présente une dépendance non linéaire aux champs lumineux entrants et produit un rayonnement cohérent. Le SRS présente deux avantages fondamentaux : 1) la vitesse, qui rend les images moins sensibles aux artefacts résultant du mouvement ou de la dégradation de l’échantillon, et 2) un excellent rapport signal-bruit (RsN). En outre, SRS présente un spectre identique à la spontanée Raman, et le signal SRS est linéairement proportionnelle à la concentration de la liaison chimique excitée1,2,3,4, 5.
Dans notre microscope, une mise en place expérimentale SRS femtoseconde (fs) est intégrée à un microscope optique inversé équipé d’une unité de balayage de miroirs rapides (Figure 1)6,7,8. Deux sources laser pulsées sont utilisées pour mettre en œuvre ce microscope. Le premier est un fs-Ti:Sa avec une durée d’impulsion d’environ 140 fs, un taux de répétition de 80 MHz, et des longueurs d’onde d’émission de l’ordre de 680-1080 nm. Le second, utilisé comme faisceau de sonde et pompé par Ti:Sa, est un oscillateur paramétrique optique synchronisé femtoseconde (SOPO), avec une durée d’impulsion d’environ 200 fs, un taux de répétition de 80 MHz et des longueurs d’onde d’émission de l’ordre de 1000-1600 nm. Il convient de noter que la différence minimale d’énergie du photon entre le faisceau Ti:Sa et SOPO est de 2500 cm-1. Par conséquent, en utilisant cette combinaison de systèmes laser, seule la région à haute fréquence C-H (2800-3200 cm-1) de spectres Raman peut être exploré6,7,8.
Afin de mettre en place un microscope SRS, il ya trois questions cruciales à considérer, qui sont décrits dans les paragraphes successifs. La première est la mise en œuvre d’une méthode de transfert de modulation à haute fréquence (voir la figure 2 et l’étape 2.1 du protocole pour une description). Dans une enquête expérimentale SRS, un paramètre crucial est la sensibilité du système. Un signal SRS est détecté comme un petit changement dans l’intensité des faisceaux d’excitation; par conséquent, il peut être corrompu par le bruit d’intensité laser et le bruit de tir. Ce problème peut être surmonté en intégrant ce système avec une méthode de transfert de modulation à haute fréquence (voir la figure 2 et l’étape 2.1 du protocole pour plus de détails). Dans cette méthode, un modulateur électro-optique (EOM) est utilisé pour moduler la pompe. La modulation transférée au faisceau de la sonde peut alors être détectée par un après avoir bloqué le faisceau de la pompe avec une pile de filtres optiques [mode de détection de gain Raman stimulé (SRG)]. La sortie est reliée par un filtre de passage bas à un amplificateur de verrouillage (LIA), qui démodule le signal mesuré. En augmentant la fréquence de modulation du faisceau à des fréquences supérieures à 1 MHz, la limite intrinsèque des peut être obtenue.
La deuxième question à considérer est l’installation d’une monture mécanique qui permet d’effectuer la détection vers l’avant et en même temps de préserver l’observation au microscope dans brightfield. En outre, il doit réduire le bruit dû aux vibrations mécaniques lors de la génération d’images et permettre le repositionnement précis du système de détection (voir la figure 3 et l’étape 2.2 du protocole).
Le troisième est la synchronisation du signal acquis par le système de détection sensible à la phase, le faisceau positionné sur l’échantillon surveillé par la tête de balayage du microscope. Afin de réaliser des images, les SM nécessitent trois signaux TTL qui sont mis à disposition par le contrôleur de microscope connecté à l’unité de tête de balayage: horloge de pixel, synchronisation de ligne, et synchronisation de cadre. La synchronisation est réalisée en contrôlant à l’aide d’une carte PCI, les trois signaux TTL, et l’acquisition d’un signal de tension au canal de sortie de LIA6,7,8. Un logiciel fait maison a été développé et décrit précédemment6,7,8, tandis que le matériel du système de synchronisation est rapporté dans la figure 4.
Une procédure fondamentale lors de l’exécution de l’imagerie SRS est l’alignement au microscope. Il est réalisé au cours de quatre étapes, qui sont décrites dans les paragraphes successifs. Le premier est le chevauchement spatial de deux faisceaux (voir l’étape 3.1 du protocole). Dans cette configuration expérimentale, les deux faisceaux ont été spatialement collinaux combinés par un miroir dichroïque. L’étape préliminaire est l’alignement de oPO et Ti:Sa de sorte que chacun atteint le microscope. Ensuite, considérant l’OPO comme un faisceau de référence et profitant d’un détecteur sensible à la position, le Ti:Sa est spatialement superposé à l’OPO.
Le deuxième aspect crucial est le chevauchement temporel de deux faisceaux (voir l’étape 3.2 du protocole). Même si la pompe et les faisceaux OPO sont parfaitement synchronisés9, puisqu’ils suivent des chemins de faisceau légèrement différents à l’intérieur du boîtier de l’OPO, à la sortie de l’OPO, ils ont un délai d’environ 5 ns et une différence spatiale de 5 cm. Par conséquent, Ti:Sa et OPO doivent être réchronométrés optiquement pour assurer un chevauchement temporel à l’échantillon. Ceci est généralement accompli avec une ligne de retard optique finement réglable, qui dans ce cas est insérée entre le Ti:Sa et le microscope (voir Figure 1). Afin d’obtenir le chevauchement temporel de deux faisceaux, deux techniques sont utilisées. Le premier est réalisé à l’aide d’un rapide et d’un oscilloscope, tandis que le second est basé sur des corrélations auto- et interoptiques. À l’aide de la première technique, un chevauchement approximatif de deux faisceaux est obtenu (incertitude de 10 ps), tandis qu’un chevauchement temporel précis de deux faisceaux est obtenu à l’aide d’un corrélateur croisé (résolution de 1 fs).
Le troisième aspect crucial est l’alignement des deux faisceaux à l’intérieur du microscope (voir l’étape 3.3 du protocole). Une observation préliminaire de la lumière blanche de l’échantillon permet d’individualiser le champ de vision souhaité (FOV). Ensuite, les faisceaux laser, entrant au microscope par un port latéral du microscope, sont alignés afin d’atteindre la montée sur la partie supérieure (Figure 3). Toutefois, pour une acquisition d’image correcte, la définition d’un certain nombre de paramètres est nécessaire (par exemple, la dimension pixel et le temps d’habiter le pixel). La fréquence d’échantillonnage doit respecter la contrainte imposée par le théorème de Nyquist afin de préserver toutes les informations dans une image, tandis que pour une correspondance correcte entre les coordonnées spatiales des pixels et la valeur SRS mesurée dans chaque pixel, le temps d’intégration de LIA doit être égal ou comparable au temps d’arrêt pixel.
Dans la dernière étape de l’alignement au microscope, de nombreux tests sont effectués pour optimiser l’alignement spatial et temporel (voir l’étape 3.4 du protocole). Un certain nombre d’images de transmission (TI) pour Ti:Sa et OPO sont acquises afin d’optimiser le chevauchement spatial. Dans un TI, un seul faisceau est utilisé, et l’intensité du faisceau transmis de l’échantillon est mesurée par un. Dans le cas de TI réalisé par OPO, le signal de sortie est directement connecté à la carte PCI, tandis que dans le cas de TI réalisé par Ti:Sa, le signal de sortie est connecté à LIA et la sortie analogique de LIA est connectée à la carte PCI. Les images de transmission sont très utiles pour optimiser le FOV, l’éclairage, la position focale des objectifs du microscope et pour vérifier si les deux faisceaux sont spatialement superposés6,7,8.
L’optimisation du chevauchement temporel de la pompe et du faisceau de la sonde est obtenue en scannant la ligne de retard à l’avance à l’avance à l’avance de 0,001 mm correspondant à un décalage temporel de 3,3 fs et en effectuant une mesure SRS en un seul point d’un échantillon de perles de polystyrène de 3 m de diamètre. L’amplitude d’un signal SRS mesure les valeurs de LA LIA, en fonction du retard de la pompe à sonde, et fournit un maximum correspondant à un chevauchement temporel exact des deux faisceaux6,7,8. Avant de conclure, il convient de noter que toutes les étapes discutées sont obligatoires pour obtenir une image de haute qualité.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie SRS a porté l’imagerie sans étiquette à de nouveaux sommets, en particulier dans les études de structures biologiques complexes telles que les lipides, qui sont fondamentales pour les cellules et l’architecture cellulaire. Les lipides sont impliqués dans de multiples voies physiologiques telles que la production de membranes biologiques, et ils servent de précurseurs biosynthétiques et de transducteurs de signaux10. Les lipides sont emballés dans des organites intracellulair…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions V. Tufano de l’IMM CNR pour sa précieuse assistance technique et Giacomo Cozzi, spécialiste des produits chez Nikon Instruments, pour des discussions utiles et un soutien continu. Ce travail a été partiellement soutenu par les programmes nationaux d’exploitation italiens PONa3 00025 (BIOforIU) et par le projet d’infrastructure de recherche paneuropéenne à grande échelle Euro-Bioimaging.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
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