Implementazione di un microscopio non lineare basato sullo scattering Raman stimolato
Summary
In questo manoscritto, viene descritta l’implementazione di un microscopio stimolato Raman scattering (SRS), ottenuto dall’integrazione di un set-up sperimentale SRS con un microscopio a scansione laser. Il microscopio SRS si basa su due sorgenti laser femtosecondo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) e un oscillatore parametrico ottico sincronizzato (OPO).
Abstract
La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) utilizza la luce di eccitazione vicino all’infrarosso; pertanto, condivide molte proprietà di imaging microscopico multi-fotonico. La modalità di imaging SRS può essere ottenuta utilizzando microscopi a scansione laser commerciali equipaggiando un rilevatore in avanti non sottoposto a scansione con filtri a banda e uno schema di rilevamento dell’amplificatore lock-in (LIA). Un layout schematico di un tipico microscopio SRS include quanto segue: due fasci laser pulsati (cioè la pompa e la sonda diretta in un microscopio a scansione), che devono essere sovrapposti sia nello spazio che nel tempo sul piano dell’immagine, quindi focalizzati da un obiettivo del microscopio il campione attraverso due specchi di scansione (SM), che raster il punto focale attraverso un piano x-y. Dopo l’interazione con il campione, gli impulsi di uscita trasmessi vengono raccolti da un obiettivo superiore e misurati da un sistema di rilevamento in avanti inserito in un microscopio invertito. Gli impulsi della pompa vengono rimossi da una pila di filtri ottici, mentre gli impulsi della sonda che sono il risultato del processo SRS che si verificano nel volume focale del campione sono misurati da un fotodiode (PD). La lettura del PD è demodulata dal LIA per estrarre la profondità di modulazione. Un’immagine bidimensionale (2D) viene ottenuta sincronizzando l’unità di rilevamento in avanti con l’unità di scansione al microscopio. In questo articolo, l’implementazione di un microscopio SRS è descritta e dimostrata con successo, così come la segnalazione di immagini prive di etichette di perline di polistirolo con diametri di 3 m. Vale la pena notare che i microscopi SRS non sono disponibili in commercio, quindi per sfruttare queste caratteristiche, la costruzione fatta in casa è l’unica opzione. Poiché la microscopia SRS sta diventando popolare in molti campi, si ritiene che questa attenta descrizione dell’implementazione del microscopio SRS possa essere molto utile per la comunità scientifica.
Introduction
Nelle applicazioni nel campo delle scienze biologiche, la microscopia SRS è emersa come un potente strumento per l’imaging senza etichette. L’idea di base della microscopia SRS è quella di combinare la forza del contrasto vibrazionale e la sua capacità di acquisire immagini in pochi secondi.
SRS è un processo in cui la differenza di frequenza tra due frequenze di raggi laser (segnale pompa e segnale stokes a frequenze diverse) corrisponde alla vibrazione molecolare di un campione studiato, causando dispersione Raman stimolata e un significativo aumento del segnale Stokes. A differenza della spettroscopia raman lineare, sRS presenta una dipendenza non lineare dai campi luminosi in entrata e produce radiazioni coerenti. SRS ha due vantaggi fondamentali: 1) velocità, che rende le immagini meno sensibili agli artefatti derivanti dal movimento o dalla degradazione del campione, e 2) un eccellente rapporto segnale-rumore (SNR). Inoltre, SRS presenta uno spettro identico al Raman spontaneo, e il segnale SRS è linearmente proporzionale alla concentrazione del legame chimico eccitato1,2,3,4, 5.
Nel nostro microscopio, un set-up sperimentale femtosecondo (fs) SRS è integrato con un microscopio ottico invertito dotato di un’unità di scansione a specchi veloci (Figura 1)6,7,8. Per implementare questo microscopio vengono utilizzate due sorgenti laser pulsate. Il primo è un fs-Ti:Sa con una durata dell’impulso di circa 140 fs, una frequenza di ripetizione di 80 MHz e lunghezze d’onda di emissione nell’intervallo di 680-1080 nm. Il secondo, utilizzato come fascio di sonda e pompato da Ti:Sa, è un oscillatore parametrico ottico sincronizzato a femtosecondo (SOPO), con una durata dell’impulso di circa 200 fs, una frequenza di ripetizione di 80 MHz e lunghezze d’onda di emissione nell’intervallo di 1000-1600 nm. Va notato che la differenza minima di energia fotone tra il fascio Ti:Sa e SOPO è di 2500 cm-1. Pertanto, utilizzando questa combinazione di sistemi laser, solo la regione Ad alta frequenza C-H (2800-3200 cm-1) di spettri Raman può essere esplorata6,7,8.
Al fine di istituire un microscopio SRS, ci sono tre questioni cruciali da considerare, che sono descritte nei paragrafi successivi. Il primo è l’implementazione di un metodo di trasferimento di modulazione ad alta frequenza (vedere Figura 2 e passaggio 2.1 del protocollo per una descrizione). In un’indagine sperimentale SRS, un parametro cruciale è la sensibilità del sistema. Un segnale SRS viene rilevato come un piccolo cambiamento nell’intensità dei raggi di eccitazione; pertanto, può essere danneggiato dal rumore di intensità del laser e dal rumore delle riprese. Questo problema può essere risolto integrando questo sistema con un metodo di trasferimento di modulazione ad alta frequenza (vedere Figura 2 e passaggio 2.1 del protocollo per i dettagli). In questo metodo, un modulatore elettro-ottico (EOM) viene utilizzato per modulare la pompa. La modulazione trasferita al fascio di sonda può quindi essere rilevata da un PD dopo aver bloccato il fascio di pompaggio con una pila di filtri ottici [modalità di rilevamento Raman guadagno Raman stimolato (SRG)]. L’uscita PD è collegata da un filtro passa-basso a un amplificatore lock-in (LIA), che demolazza il segnale misurato. Aumentando la frequenza di modulazione del fascio a frequenze superiori a 1 MHz, è possibile ottenere il limite intrinseco di PD.
La seconda questione da considerare è l’installazione di un supporto meccanico che permette di effettuare il rilevamento in avanti e allo stesso tempo di preservare l’osservazione al microscopio in campo luminoso. Inoltre, deve ridurre il rumore dovuto alle vibrazioni meccaniche durante la generazione di immagini e consentire il riposizionamento preciso del sistema di rilevamento (vedere la Figura 3 e il passaggio 2.2 del protocollo).
Il terzo è la sincronizzazione del segnale acquisito dallo schema di rilevamento sensibile alla fase, con il fascio posizionato sul campione monitorato dalla testina di scansione del microscopio. Per realizzare le immagini, le SM richiedono tre segnali TTL che vengono resi disponibili dal controller del microscopio collegato all’unità di scansione: pixel clock, line sync e frame sync. La sincronizzazione si ottiene controllando utilizzando una scheda PCI, i tre segnali TTL e l’acquisizione di un segnale di tensione sul canale di uscita di LIA6,7,8. Un software fatto in casa è stato sviluppato e descritto in precedenza6,7,8, mentre l’hardware del sistema di sincronizzazione è riportato in Figura 4.
Una procedura fondamentale durante l’esecuzione dell’imaging SRS è l’allineamento al microscopio. Si realizza nel corso di quattro fasi, descritte nei paragrafi successivi. Il primo è la sovrapposizione spaziale di due fasci (vedere il passaggio 3.1 del protocollo). In questo set-up sperimentale, i due fasci sono stati spazialmente collitrati combinati da uno specchio dicroico. La fase preliminare è l’allineamento di OPO e Ti:Sa in modo che ognuno raggiunga il microscopio. Quindi, considerando l’OPO come una trave di riferimento e sfruttando un rilevatore sensibile alla posizione, il Ti:Sa è sovrapposto spazialmente a OPO.
Il secondo aspetto cruciale è la sovrapposizione temporale di due fasci (vedere il passaggio 3.2 del protocollo). Anche se la pompa e le travi OPO sono perfettamente sincronizzate9, dal momento che seguono percorsi di fascio leggermente diversi all’interno dell’alloggiamento OPO, all’uscita OPO hanno un ritardo di tempo di circa 5 ns e differenza spaziale di 5 cm. Pertanto, Ti:Sa e OPO richiedono di essere riprogrammati otticamente per garantire la sovrapposizione temporale sul campione. Questa operazione viene in genere eseguita con una linea di ritardo ottica finemente regolabile, che in questo caso viene inserita tra il Ti:Sa e il microscopio (vedere la figura 1). Per ottenere la sovrapposizione temporale di due travi, vengono utilizzate due tecniche. Il primo viene effettuato utilizzando una PD veloce e oscilloscopio, mentre il secondo si basa su correlazioni auto e cross-ottiche. Utilizzando la prima tecnica, si ottiene una sovrapposizione approssimativa di due travi (incertezza di 10 ps), mentre una sovrapposizione temporale accurata di due travi si ottiene utilizzando un correlato recorrelato incrociato (risoluzione di 1 fs).
Il terzo aspetto cruciale è l’allineamento dei due fasci all’interno del microscopio (vedere la fase 3.3 del protocollo). Un’osservazione preliminare a luce bianca del campione permette di individuare il campo visivo desiderato (FOV). Successivamente, i raggi laser, che entrano nel microscopio da una porta laterale del microscopio, sono allineati per raggiungere il PD montato sulla parte superiore (Figura 3). Tuttavia, per una corretta acquisizione dell’immagine, è necessario impostare una serie di parametri (ad esempio, dimensione in pixel e tempo di peritura dei pixel). La frequenza di campionamento deve rispettare il vincolo imposto dal teorema di Nyquist al fine di conservare tutte le informazioni in un’immagine, mentre per una corretta corrispondenza tra le coordinate spaziali dei pixel e il valore SRS misurato in ogni pixel, il tempo di integrazione di LIA dovrebbe essere uguale o paragonabile al tempo di dimora dei pixel.
Nella fase finale dell’allineamento al microscopio, vengono effettuati numerosi test per ottimizzare l’allineamento spaziale e temporale (vedere il passaggio 3.4 del protocollo). Un certo numero di immagini di trasmissione (TI) sia per Ti:Sa che per OPO vengono acquisite al fine di ottimizzare la sovrapposizione spaziale. In un TI, viene utilizzato un singolo fascio e l’intensità del fascio trasmesso dal campione viene misurata da una PD. Nel caso di TI realizzato da OPO, il segnale di uscita PD è collegato direttamente alla scheda PCI, mentre nel caso di TI realizzato da Ti:Sa, il segnale di uscita PD è collegato a LIA e l’uscita analogica di LIA è collegata alla scheda PCI. Le immagini di trasmissione sono molto utili per ottimizzare il FOV, l’illuminazione, la posizione focale degli obiettivi del microscopio e per verificare se i due fasci sono sovrapposti spazialmente6,7,8.
L’ottimizzazione della sovrapposizione temporale della pompa e della trave della sonda si ottiene scansionando la linea di ritardo con passi di 0,001 mm corrispondenti a uno spostamento temporale di 3,3 fs ed effettuando una misurazione SRS in un unico punto di un campione di perline di polistirolo di 3 m di diametro. L’ampiezza di un segnale SRS misura i valori di LIA, in funzione del ritardo sonda-pompa, e fornisce un massimo corrispondente con l’esatta sovrapposizione temporale delle due travi6,7,8. Prima di concludere, va notato che tutti i passaggi discussi sono obbligatori per ottenere un’immagine di alta qualità.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopia SRS ha portato l’imaging senza etichette a nuove altezze, in particolare negli studi di strutture biologiche complesse come i lipidi, fondamentali per le cellule e l’architettura cellulare. I lipidi sono coinvolti in molteplici percorsi fisiologici come la produzione di membrane biologiche, e servono come precursori biosintetici e trasduttori di segnale10. I lipidi sono confezionati in organelli intracellulari specializzati, chiamati anche goccioline lipidiche (LD). I loro diametri …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo V. Tufano di IMM CNR per la sua preziosa assistenza tecnica e Giacomo Cozzi, product specialist di Nikon Instruments, per discussioni utili e supporto continuo. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dai programmi operativi nazionali italiani PONa3 00025 (BIOforIU) e dal progetto euro-Bioimaging sulle infrastrutture di ricerca paneuropee.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
Referências
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