Implementering av et ikke-lineær mikroskop basert på stimulert Raman spredning
Summary
I dette manuskriptet, er implementeringen av en stimulert Raman spredning (SRS) mikroskop, fremstilt ved integrering av en SRS eksperimentell oppsett med en laserskanning mikroskop, beskrevet. SRS-mikroskopet er basert på to femtosecond (FS) laser kilder, en ti-Sapphire (ti: sa) og synkronisert optisk parametrisk oscillator (OPO).
Abstract
Stimulert Raman spredning (SRS) mikroskopi bruker nær-infrarød eksitasjon lys; Derfor, det aksjer mange multi-Foton mikroskopisk Imaging egenskaper. SRS Imaging modalitet kan fås ved hjelp av kommersielle laser-skanning mikroskop ved å utstyre med en ikke-descanned forover detektor med riktig bånd pass filtre og lock-in forsterker (LIA) deteksjon ordningen. Et skjematisk oppsett av et typisk SRS-mikroskop inkluderer følgende: to pulserende laserstråler (dvs. pumpen og sonden som er rettet i et skanne mikroskop), som må overlappes i både rom og tid på bildet flyet, deretter fokusert av et mikroskop objektiv i prøven gjennom to skanning speil (SMs), som raster fokus stedet over et x-y fly. Etter interaksjon med prøven, er overført utgang pulser samlet av en øvre mål og målt ved et fremover deteksjon system satt inn i et invertert mikroskop. Pumpe pulser fjernes av en stabel med optiske filtre, mens sonde pulser som er resultatet av SRS-prosessen som forekommer i det sentrale volumet i prøven måles av en PHOTODIODE (PD). Den avlesning av PD er demodulerte av LIA å trekke ut moduleringshjul dybden. Det oppnås et todimensjonal (2D) bilde ved å synkronisere den fremre deteksjons enheten med skanne enheten i mikroskopet. I dette dokumentet er implementeringen av et SRS-mikroskop beskrevet og vellykket demonstrert, samt rapportering av etikett frie bilder av polystyren perler med diameter på 3 μm. Det er verdt å merke seg at SRS mikroskop ikke er kommersielt tilgjengelig, så for å dra nytte av disse egenskapene, er hjemmelaget konstruksjonen det eneste alternativet. Siden SRS mikroskopi er blitt populær i mange felt, er det antatt at denne nøye beskrivelse av SRS mikroskop gjennomføringen kan være svært nyttig for det vitenskapelige samfunnet.
Introduction
Inne livet vitenskap søknadene, SRS mikroskopi har smaragd idet kraftfull verktøyet for avmerke-ledig tenkelig. Den grunnleggende ideen om SRS mikroskopi er å kombinere styrken på vibrasjonsmedisin kontrast og dens evne til å tilegne seg bilder i løpet av få sekunder.
SRS er en prosess hvor frekvens forskjellen mellom to laserstråler frekvenser (pumpe signal og Stokes signal ved forskjellige frekvenser) matcher den molekylære vibrasjon av en undersøkt prøve, forårsaker stimulert Raman spredning og en betydelig økningen i Stokes-signalet. I motsetning til lineær Raman spektroskopi, viser SRS en ikke-lineær avhengighet av innkommende lys felt og produserer sammenhengende stråling. SRS har to grunnleggende fordeler: 1) hastighet, noe som gjør bildene mindre følsomme for gjenstander som oppstår fra prøve bevegelse eller-degradering, og 2) et utmerket signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg viser SRS et spektrum som er identisk med den spontane Raman, og SRS-signalet er lineært proporsjonal med konsentrasjonen av det kjemiske båndet spent1,2,3,4, fempå.
I vårt mikroskop er en femtosecond (FS) SRS eksperimentell oppsett integrert med en invertert optisk mikroskop utstyrt med en rask speil skanning enhet (figur 1)6,7,8. To pulserende laser kilder brukes til å implementere dette mikroskopet. Den første er en FS-ti: sa med en puls varighet på ca 140 FS, repetisjon rate på 80 MHz, og utslipps bølgelengder i området 680-1080 NM. Den andre, brukes som sonde strålen og pumpes av ti: sa, er en femtosecond synkronisert optisk parametrisk oscillator (SOPO), med en puls varighet på ca 200 FS, repetisjon rate på 80 MHz, og utslipps bølgelengder i området 1000-1600 NM. Det bør bemerkes at minimum Foton energi forskjellen mellom ti: sa og SOPO strålen er 2500 cm-1. Derfor bruker denne kombinasjonen av laser systemer, bare høy frekvens C-H region (2800-3200 cm-1) av Raman Spectra kan utforskes6,7,8.
For å sette opp et SRS-mikroskop, er det tre viktige problemer å vurdere, som er beskrevet i de etterfølgende avsnittene. Den første er gjennomføringen av en høyfrekvent modulerings metode (se figur 2 og trinn 2,1 av protokollen for en beskrivelse). I en SRS eksperimentell undersøkelse er en avgjørende parameter følsomheten til systemet. En SRS-signal oppdages som en liten endring i intensiteten av eksitasjon bjelker; Derfor kan det bli ødelagt av laser intensitet støy og skjøt støy. Dette problemet kan overvinnes ved å integrere dette systemet med en høyfrekvent modulerings metode (se figur 2 og trinn 2,1 av protokollen for detaljer). I denne metoden brukes en elektro-optikk (EOM) til å modulere pumpen. Moduleringen overført til sonden strålen kan deretter oppdages av en PD etter blokkering av pumpen strålen med en stabel av optiske filtre [stimulert Raman Gain (SRG) deteksjon modus]. PD-utgangen er koblet sammen med et low pass-filter til en låse forsterker (LIA), som demodulerer det målte signalet. Ved å øke modulerings frekvensen til strålen til frekvenser over 1 MHz, kan den iboende grensen for PDs skaffes.
Det andre problemet å vurdere er installasjon av en mekanisk montere som tillater å utføre fremover deteksjon og samtidig å bevare mikroskop observasjon i brightfield. I tillegg har det å redusere støyen på grunn av mekanisk vibrasjon under generering av bilder og for å tillate nøyaktig omplassering av deteksjonssystemet (se Figur 3 og trinn 2,2 av protokollen).
Den tredje er synkronisering av signalet ervervet av fase-sensitive deteksjon ordningen, med strålen plassert på prøven overvåkes av skanningen hodet av mikroskopet. For å realisere bilder krever SMs tre TTL-signaler som gjøres tilgjengelig av mikroskop kontrolleren som er koblet til skannehodet heten: Pikselklokke, linje synkronisering og ramme synkronisering. Synkroniseringen oppnås ved å kontrollere ved hjelp av et PCI-kort, de tre TTL-signalene, og oppkjøpet av et spenningssignal ved utgangs kanalen til Lia6,7,8. En hjemmelaget programvare er utviklet og beskrevet tidligere6,7,8, mens maskinvaren i synkroniseringen systemet er rapportert i Figur 4.
En grunnleggende prosedyre ved utføring av SRS-avbildning er justering av mikroskop. Det er realisert i løpet av fire trinn, som er beskrevet i de påfølgende avsnittene. Den første er den romlige overlapping av to bjelker (se trinn 3,1 av protokollen). I denne eksperimentelle satt opp, de to bjelkene var romlig collinearly kombinert med en dichroic speil. Det foreløpige trinnet er justeringen av OPO og ti: sa slik at hver når mikroskopet. Så, vurderer OPO som en referanse bjelke og dra nytte av en posisjon følsom detektor, ti: sa er romlig overlappes til OPO.
Det andre avgjørende aspektet er den timelige overlapping av to bjelker (se trinn 3,2 av protokollen). Selv om pumpen og OPO bjelker er perfekt synkronisert9, siden de følger litt annerledes stråle stier inne i OPO bolig, ved OPO exit de har en tidsforsinkelse på ca 5 NS og romlig forskjell på 5 cm. Derfor krever ti: sa og OPO å bli re-timet optisk for å sikre timelig overlapping ved prøven. Dette oppnås vanligvis med en fin tunable optisk forsinkelses linje, som i dette tilfellet er satt inn mellom ti: sa og mikroskopet (se figur 1). For å oppnå den timelige overlapping av to bjelker, er to teknikker som brukes. Den første er utført ved hjelp av en rask PD og oscilloskop, mens den andre er basert på auto-og kryss-optiske sammenhenger. Ved hjelp av den første teknikken, en grov overlapping av to bjelker er oppnådd (usikkerhet på 10 PS), mens en nøyaktig Temporal overlapping av to bjelker er innhentet ved hjelp av en Cross-multibane korrelator (oppløsning på 1 FS).
Det tredje avgjørende aspektet er justeringen av de to bjelkene inne i mikroskopet (se trinn 3,3 av protokollen). En foreløpig hvit lys observasjon av prøven gjør det mulig å individuate ønsket synsfelt (FOV). Deretter justeres laserstråler, som går inn i mikroskopet med en side port på mikroskopet, for å nå PD montert på den øvre delen (Figur 3). Hvis du vil ha riktig bilde anskaffelse, må du imidlertid angi en rekke parametere (for eksempel pikseldimensjon og piksel levetid). Sampling frekvensen må respektere begrensningen pålagt av Nyquist ‘ s setning for å bevare all informasjon i et bilde, mens for en riktig korrespondanse mellom romlige koordinater piksler og SRS-verdien målt i hver piksel, integreringen tid av LIA bør være lik eller sammenlignes med Pixel botid.
I det siste trinnet av mikroskop justering, utføres en rekke tester for å optimalisere den romlige og timelige justeringen (se trinn 3,4 av protokollen). En rekke overføring bilder (TI) for både ti: sa og OPO er ervervet for å optimalisere romlig overlapping. I en TI brukes en enkelt stråle, og den overførte stråle intensiteten fra prøven måles av en PD. I tilfelle av TI realisert ved OPO, PD utgangssignalet er direkte koblet til PCI-kort, mens i tilfelle av TI realisert av ti: sa, er PD utgangssignalet koblet til LIA og analog utgang av LIA er koblet til PCI-kort. Overføring bildene er svært nyttig for å optimalisere FOV, belysningen, fokus plasseringen av mikroskop mål og for å kontrollere om de to bjelkene er romlig overlappes6,7,8.
Optimaliseringen av pumpen og sonden strålen timelige overlapping oppnås ved å skanne forsinkelsen linje med trinn på 0,001 mm som tilsvarer en 3,3 FS tidsforskyvning og utføre en SRS-måling i et enkelt punkt av en polystyren perle sample 3 μm i diameter. Amplituden til et SRS-Signalmåler verdier fra lia, som en funksjon av sonden-pumpen forsinkelse, og gir en maksimal tilsvarende med eksakt Temporal overlapping av de to bjelkene6,7,8. Før avsluttende, bør det bemerkes at alle diskuterte trinnene er obligatoriske for å få et bilde av høy kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
SRS mikroskopi har tatt etikett fri avbildning til nye høyder, spesielt i studier av komplekse biologiske strukturer som lipider, som er grunnleggende for celler og cellulær arkitektur. Lipider er involvert i flere fysiologiske veier som produksjon av biologiske membraner, og de fungerer som biosyntetiske forløpere og signal transdusere10. Lipider er pakket inn i spesialiserte intracellulære organeller, også kalt lipid dråper (LDs). Deres diameter varierer fra noen titalls nanometer til tita…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi setter pris på V. Tufano fra IMM CNR for hans verdifulle tekniske assistanse og Giacomo Cozzi, produkt spesialist fra Nikon Instruments, for nyttige diskusjoner og kontinuerlig støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av italienske nasjonale operative programmer PONa3 00025 (BIOforIU) og av euro-Bioimaging stor skala Europas forskning infrastruktur prosjektet.
Materials
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25×36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
Referências
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D’Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
