Implementação de um microscópio não-linear baseado em espalhamento Raman estimulado

Summary

Neste manuscrito, é descrita a implementação de um microscópio de espalhamento Raman (SRS) estimulado, obtido pela integração de um conjunto experimental de SRS com um microscópio de varredura a laser. O microscópio de SRS é baseado em duas fontes do laser do femtossegundo (FS), em um ti-safira (ti: SA) e em oscilador paramétrico ótico sincronizado (OPO).

Abstract

A microscopia de espalhamento Raman (SRS) estimulada usa luz de excitação near-infrared; Conseqüentemente, compartilha de muitas propriedades microscópicas da imagem latente do multi-fóton. A modalidade da imagem latente de SRS pode ser obtida usando microscópios comerciais da laser-exploração equipando com um detector dianteiro não-descanned com filtros apropriados do bandpass e o esquema de deteção do fechamento-no amplificador (LIA). Uma disposição esquemática de um microscópio típico de SRS inclui o seguinte: dois feixes de laser pulsado, (isto é, a bomba e a ponta de prova dirigidas em um microscópio da exploração), que deva ser sobreposta no espaço e no tempo no plano da imagem, a seguir focalizada por um objetivo do microscópio em a amostra através de dois espelhos de digitalização (SMs), que raster o ponto focal através de um plano x-y. Após a interação com a amostra, os pulsos de saída transmitidos são coletados por um objetivo superior e medidos por um sistema de detecção de avanço inserido em um microscópio invertido. Os pulsos da bomba são removidos por uma pilha de filtros óticos, visto que os pulsos da ponta de prova que são o resultado do processo de SRS que ocorre no volume focal do espécime são medidos por um fotodiodo (paládio). O leitura do paládio é demodulado pelo lia para extrair a profundidade da modulação. Uma imagem bidimensional (2D) é obtida sincronizando a unidade de detecção direta com a unidade de digitalização do microscópio. Neste trabalho, a implementação de um microscópio de SRS é descrita e demonstrada com sucesso, bem como a comunicação de imagens sem rótulo de grânulos de poliestireno com diâmetros de 3 μm. Vale a pena notar que os microscópios SRS não estão disponíveis comercialmente, por isso, a fim de tirar proveito dessas características, a construção caseira é a única opção. Desde que a microscopia de SRS está tornando-se popular em muitos campos, acredita-se que esta descrição cuidadosa da implementação do microscópio de SRS pode ser muito útil para a comunidade científica.

Introduction

Em aplicações da ciência da vida, a microscopia de SRS emergiu como a ferramenta poderosa para a imagem latente Label-Free. A idéia básica da microscopia SRS é combinar a força do contraste vibracional e sua capacidade de adquirir imagens em poucos segundos.

SRS é um processo em que a diferença de frequência entre duas freqüências de feixes de laser (sinal da bomba e sinal Stokes em diferentes frequências) coincide com a vibração molecular de uma amostra investigada, causando dispersão Raman estimulado e uma significativa aumento do sinal Stokes. Ao contrário da Espectroscopia Raman linear, o SRS apresenta uma dependência não linear dos campos de luz recebidos e produz radiação coerente. SRS tem duas vantagens fundamentais: 1) velocidade, o que torna as imagens menos sensíveis aos artefactos resultantes do movimento da amostra ou degradação, e 2) uma excelente relação sinal-ruído (SNR). Além, SRS exibe um espectro idêntico ao Raman espontâneo, e o sinal de SRS é linearmente proporcional à concentração da ligação química excited^{1,2,3,4, a 5}.

Em nosso microscópio, um femtossegundo (FS) SRS experimental set-up é integrado com um microscópio óptico invertido equipado com uma unidade de digitalização de espelhos rápidos (Figura 1)^6,7,8. Duas fontes de laser pulsada são usadas para implementar este microscópio. O primeiro é um FS-ti: SA com uma duração de pulso de aproximadamente 140 FS, taxa de repetição de 80 MHz, e comprimentos de onda de emissão na faixa de 680-1080 nm. O segundo, usado como feixe de sonda e bombeado por ti: SA, é um oscilador paramétrico óptico sincronizado femtossegundo (Sopo), com uma duração de pulso de aproximadamente 200 FS, taxa de repetição de 80 MHz e comprimentos de onda de emissão na faixa de 1000-1600 nm. Deve-se notar que a diferença mínima de energia do fóton entre o feixe ti: SA e SOPO é de 2500 cm^-1. Portanto, usando essa combinação de sistemas a laser, apenas a região C-H de alta frequência (2800-3200 cm^-1) dos espectros Raman pode ser explorada^6,7,8.

A fim estabelecer um microscópio de SRS, há três edições cruciais a considerar, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a implementação de um método de transferência de modulação de alta frequência (ver Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para uma descrição). Em uma investigação experimental SRS, um parâmetro crucial é a sensibilidade do sistema. Um sinal de SRS é detectado como uma pequena alteração na intensidade dos feixes de excitação; Conseqüentemente, pode ser corrompido pelo ruído da intensidade do laser e pelo ruído do tiro. Esta edição pode ser superada integrando este sistema com um método de transferência de alta freqüência da modulação (veja Figura 2 e etapa 2,1 do protocolo para detalhes). Neste método, um modulador electro-óptico (EOM) é usado para modular a bomba. A modulação transferida para o feixe de sonda pode então ser detectada por um PD depois de bloquear o feixe da bomba com uma pilha de filtros ópticos [estimulado o ganho Raman (SRG) modo de detecção]. A saída PD é conectada por um filtro passa-baixo para um amplificador de bloqueio (LIA), que demodula o sinal medido. Ao aumentar a frequência de modulação do feixe para freqüências acima de 1 MHz, o limite intrínseco do PDs pode ser obtido.

A segunda edição a considerar é a instalação de uma montagem mecânica que permita realizar a deteção para diante e ao mesmo tempo preservar a observação do microscópio no brightfield. Além, tem que reduzir o ruído devido à vibração mecânica durante a geração de imagens e permitir o reposicionamento preciso do sistema de deteção (veja Figura 3 e etapa 2,2 do protocolo).

A terceira é a sincronização do sinal adquirido pelo esquema de detecção sensível à fase, com o feixe posicionado na amostra monitorada pelo cabeçote de varredura do microscópio. A fim realizar imagens, os SMs exigem três sinais do TTL que são disponibilizados pelo controlador do microscópio conectado à unidade da cabeça da varredura: pulso de disparo do pixel, sincronização da linha, e sincronização do frame. A sincronização é conseguida controlando usando um cartão do PCI, os três sinais do TTL, e a aquisição de um sinal da tensão no canal de saída de lia^6,7,8. Um software caseiro foi desenvolvido e descrito anteriormente^6,7,8, enquanto o hardware do sistema de sincronização é relatado na Figura 4.

Um procedimento fundamental ao realizar a imagem latente de SRS é alinhamento do microscópio. Realiza-se ao longo de quatro etapas, que são descritas nos parágrafos sucessivos. A primeira é a sobreposição espacial de duas vigas (ver passo 3,1 do protocolo). Nesta fase experimental, as duas vigas foram combinadas espacialmente por um espelho dicróico. A etapa preliminar é o alinhamento de OPO e de ti: SA de modo que cada um alcangue o microscópio. Em seguida, considerando OPO como um feixe de referência e tirando proveito de um detector de posição sensível, o ti: SA é espacialmente sobreposta a OPO.

O segundo aspecto crucial é a sobreposição temporal de duas vigas (ver passo 3,2 do protocolo). Mesmo se a bomba e os feixes de OPO são perfeitamente sincronizados⁹, uma vez que seguem caminhos de feixe ligeiramente diferentes dentro da habitação opo, na saída opo eles têm um atraso de cerca de 5 ns e diferença espacial de 5 cm. Portanto, ti: SA e OPO exigem re-cronometrado opticamente para garantir a sobreposição temporal na amostra. Isso normalmente é realizado com uma linha de retardo óptico finamente sintonável, que neste caso é inserida entre o ti: SA e o microscópio (veja a Figura 1). A fim de obter a sobreposição temporal de dois feixes, duas técnicas são usadas. O primeiro é realizado usando um PD rápido e osciloscópio, enquanto o segundo é baseado em correlações auto e Cross-Optical. Usando a primeira técnica, uma sobreposição áspera de dois feixes é obtida (incerteza de 10 picosegundo), quando uma sobreposição temporal exata de dois feixes for obtida usando um cross-correlator (definição de 1 FS).

O terceiro aspecto crucial é o alinhamento das duas vigas no interior do microscópio (ver passo 3,3 do protocolo). Uma observação preliminar da luz branca da amostra permite individuar o campo de visão desejado (FOV). Em seguida, os feixes de laser, entrando no microscópio por uma porta lateral do microscópio, são alinhados a fim alcangar o paládio montado na parte superior (Figura 3). No entanto, para uma aquisição de imagem correta, é necessário definir um número de parâmetros (por exemplo, dimensão de pixel e tempo de permanência do pixel). A frequência de amostragem deve respeitar a restrição imposta pelo teorema de Nyquist, a fim de preservar todas as informações em uma imagem, enquanto que para uma correspondência correta entre as coordenadas espaciais de pixels e o valor de SRS medido em cada pixel, o tempo de integração de LIA deve ser igual ou comparável ao tempo de permanência do pixel.

Na etapa final do alinhamento do microscópio, são realizados inúmeros testes para otimizar o alinhamento espacial e temporal (ver etapa 3,4 do protocolo). Uma série de imagens de transmissão (TI) para ti: SA e OPO são adquiridas a fim de otimizar a sobreposição espacial. Em um TI, um único feixe é usado, e a intensidade transmitida do feixe da amostra é medida por um PD. No caso de TI realizado por OPO, o sinal de saída PD está diretamente conectado ao cartão PCI, enquanto no caso de TI realizado por ti: SA, o sinal de saída PD é conectado a LIA e saída analógica de LIA está conectado a placa PCI. As imagens de transmissão são muito úteis para otimizar o FOV, a iluminação, a posição focal dos objetivos do microscópio e verificar se as duas vigas são espacialmente sobrepostas^6,7,8.

A otimização da sobreposição temporal da bomba e do feixe de sonda é obtida através da digitalização da linha de retardo com etapas de 0, 1 mm correspondendo a um deslocamento de tempo de 3,3 FS e realizando uma medição de SRS em um único ponto de uma amostra de grânulo de poliestireno de 3 μm de diâmetro. A amplitude de um sinal de SRS mede valores de lia, em função do retardo da sonda-bomba, e fornece um máximo correspondente com a sobreposição temporal exata das duas vigas^6,7,8. Antes de concluir, deve-se notar que todas as etapas discutidas são obrigatórias para obter uma imagem de alta qualidade.

Protocol

1. iniciando o sistema a laser Verifique se a temperatura dos resfriadores é mantida a ou abaixo de 20 ° c. Verifique se a unidade de controle de umidade está funcionando corretamente e a umidade é mantida em um valor em torno de 40%. Ligue o laser ti: SA, seguindo rigorosamente as instruções do manual. Defina o comprimento de onda para 810 nm. Ligue o OPO e o mini-computador conectado. Execute o aplicativo que controla o laser OPO. Selecione bypas…

Representative Results

Um exemplo de medida SRS (i.e., medida SRS em um único ponto da amostra) é relatado na Figura 7. Quando as vigas não são sobrepostas no tempo ou no espaço, o resultado obtido é relatado na figura 8a. Em off-Resonance, a amplitude do sinal medido pela LIA é zero, enquanto a fase de sinal medido pela LIA salta entre valores negativos e positivos. Enquanto que, quando as vigas são sobrepostas no espaço, movendo a linha de atraso em um intervalo apro…

Discussion

A microscopia de SRS tomou a imagem latente Label-Free às alturas novas, especial nos estudos de estruturas biológicas complexas tais como lipídios, que são fundamentais às pilhas e à arquitetura celular. Os lipídios estão envolvidos em múltiplas vias fisiológicas, como a produção de membranas biológicas, e servem como precursores biossintéticos e Transdutores de sinal¹⁰. Os lipídios são embalados em organelas intracelulares especializadas, também denominadas gotículas lipídicas…

Materials

Acquisation tool	Nikon	Nikon C2Tool	Acquisation supported tool
APE Pulse link control software	APE-	APE Pulse link control software	software control
Autocorrelator	APE	APE PulseCheck USB 50	Autocorrelator
Detector	Thorlabs	Thorlabs DET10A	Photodiode
Detector card	Thorlabs	Thorlabs VRC	IR detector Card
Dichroic mirror	Semrock	Semrock FF875-Di01-25X36	Dichroic mirror
Dichroic mirror	Semrock	FF875-Di01-25×36	Dichroic mirror
EOM	Conoptics	(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).	Pockels cell
Fast detector	Thorlabs	Thorlabs DET025AL/M	Photodiode
Fast mirror scanning unit	Nikon	C2	Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA	Coherent	Coherent Chameleon Ultra II	Chameleon Ultra II
Function generator	TTi	TG5011 AIM – TTi	Function generator
Inverted optical microscope	Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier	Standford Research System	SR844-200 MHz dual phase	A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter,	Semrock	NF03-808E-25	Notch filter
Optical delay line	Newport	Newport M-ILS200CC	Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator	Coherent	Coherent Compact OPO	Coherent Compact OPO
Oscilloscope	WaveRunner	640Zi 4GHz OSC/LeCroy	Digital Oscilloscope
PCI Card	National instrument	NI PCIe 6363	Data acquisation card
Position Sensors Detectors	Newport	Newport Conex PSD9	Position detector sensor
Power meter head	Coherent	PowerMax PM10,	Laser power detector
Translation Stages	Thorlabs	Thorlabs PT1/M	Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer