免疫シナプス形成中のB細胞におけるオルガネラダイナミクスの研究
Summary
本明細行では、ISの形成中にBリンパ球における細胞偏光事象を特徴付ける2つのアプローチについて説明する。第1に、シナプス膜におけるオルガネラ募集および細胞骨格再配列の定量化を含む。第2は、免疫シナプスに偏光を受けるセントロソームの組成の変化を特徴付ける生化学的アプローチである。
Abstract
B細胞受容体(BCR)による表面つな起きた抗原の認識は、シグナル伝達と抗原取り込みの両方が調整される免疫シナプス(IS)の形成を引き起こす。IS形成は、セントロソームのシナプス膜およびリソソームおよびゴルジ装置などの関連細胞内器官への偏光募集を伴う動的アクチンリモデリングを含む。アクチンリモデリングの初期段階では、B細胞は細胞表面を増加させ、シナプスで集められた抗原BCR複合体の量を最大化することができます。特定の条件下では、B細胞が硬質表面に関連する抗原を認識すると、このプロセスはリソソームの局所的な募集および分泌に結合され、抗原抽出を容易にすることができる。取り込まれた抗原は、ペプチドに処理するための特殊なエンドリソソームコンパートメントに内部化され、これは主要な組織適合性複合体II(MHC-II)分子にロードされ、Tヘルパー細胞へのさらなるプレゼンテーションを行う。したがって、ISの形成に関連するオルガネラダイナミクスを研究することは、B細胞がどのように活性化されるかを理解する上で重要である。本稿では、B細胞におけるISの形成に関連する細胞内小器官位置および細胞骨格の再配列の変化を研究するために用いられるイメージングと生化学的手法の両方について議論する。
Introduction
Bリンパ球は、異なる脅威に対する抗体の産生および侵入病原体に対する抗体を産生する適応免疫系の不可欠な部分である。抗体産生の効率は、B細胞が可溶性または表面つな形1、2のいずれかで遭遇した抗原を獲得、処理および提示する能力によって決定される。提示細胞の表面に付着した抗原の認識は、BCRによって、IS3、4と呼ぶ近接細胞間接触の形成につながる。この動的なプラットホームの中でBCR依存の下流のシグナル伝達および内因性リソソームのコンパートメントへの抗原の内部化の両方が起こる。取り込み抗原はMHC-II分子に処理され、組み立てられ、その後Tリンパ球に提示される。生産的なB-T相互作用は、B-T細胞協調と呼び、Bリンパ球が適切なシグナルを受け取ることを可能にし、抗体産生血漿細胞または記憶細胞への分化を促進する8。
B細胞による抗原抽出には2つのメカニズムが関与している。最初の1つは、シナプス裂裂5、6で募集と融合を受けるリソソームに由来するプロテアーゼの分泌に依存しています。第2のものは、クラトリンコーティングされたピット7に内在する抗原含有膜の浸位を引き起こすミオシンIIA媒介引力に依存する。抗原抽出のモードは、抗原が見つかった膜の物理的特性に依存します。それにもかかわらず、いずれの場合も、B細胞は2つの主要な改造事象を受ける:アクチン細胞骨格の再編成とISへの小器官の偏光。アクチン細胞骨格リモデリングは、シナプス膜におけるアクチン依存性突起が抗原と接触する表面を増加させる初期広がり段階を伴う。これに続いて、抗原と組み合わせたBBCRが、分子モーターとアクチン細胞骨格の協調作用によってISの中心に集中する収縮期が続く。11.オルガネラの偏光もアクチン細胞骨格の改造に依存する。例えば、セントロソームは核から結合解除され、関連するアクチンの局所脱重合によって、この小器官をIS5、12に再配置することを可能にする。B細胞において、セントロソームを1つの細胞極(IS)に再配置すると、シナプス膜へのリソソーム募集が導かれ、分泌時に表面つなつ付け抗原6の抽出および/または処理を容易にすることができる。ISで募集されたリソソームは、T細胞13に提示されるエンドソームコンパートメントにおけるペプチド-MHC-II複合体の形成を支持するMHC-IIで濃縮される。さらに、ゴルジ装置はIS14に密接に採用されることも観察されており、分泌経路からのゴルジ由来小胞が抗原の抽出および/または処理に関与する可能性があることを示唆している。
全体として、シナプス形成中のB細胞における細胞内小器官および細胞骨格の再配列は、そのさらなる活性化に必要な効率的な抗原獲得および処理を可能にする重要なステップである。本研究では、B細胞におけるイメージングおよび生化学的解析を行う方法に関する詳細なプロトコルを紹介し、ISの形成に関連するオルガネラの細胞内改造を研究する。これらの技術には、(i)抗原被覆ビーズで活性化されたB細胞の免疫蛍光および画像解析および抗原被覆線のスリップが含まれ、ISに動員される細胞内成分の可視化と定量が可能である(ii))スクロース勾配上の超遠心分離によるB細胞中のセントロソーム富化画分の単離は、セントロソームに関連するタンパク質の同定を可能にし、細胞極性の調節に関与する可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、Bリンパ球がISの形成を促進するために細胞内アーキテクチャを再編成する方法を研究する包括的な方法を説明する。本研究では、B細胞活性化時のセントロソーム、ゴルジ装置、リソソームなどのオルガネラの細胞内分布を定量化するイメージング技術の使用と、それらがISに偏光する方法を含む。さらに、B細胞活性化時のセントロソーム組成の変化を研究するための生化学的アプロ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y.は、FONDECYT#1180900からの研究助成金によって支援されています。J.I.、D.F.、J.L.は、コミシオン・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジアのフェローシップによって支援されました。私たちは、ビデオの録画と編集のためにポンティフィシア大学カトリカデチリからデビッド・オソリオに感謝します。
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
Referências
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