Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.
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Artigo de método
Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais
Neste artigo
Resumo
Resumo
MicroRNAs (miRNAs) são pequenas RNAs regulatórias que são reconhecidas para modular inúmeras vias de sinalização intracelular em várias doenças, incluindo cânceres. Esses pequenos RNAs regulatórios interagem principalmente com as 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) de seus RNAs de mensageiro alvo (mRNAs), resultando na inibição dos processos de decodificação de mRNAs e no aumento das degradações de mRNA alvo. Com base nos níveis de expressão e nas funções intracelulares, os miRNAs são capazes de servir como fatores regulatórios de mRNAs oncogênicas e supressoras de tumores. A identificação de genes-alvo de boa-fé de um miRNA entre centenas ou mesmo milhares de alvos computacionalmente previstos é um passo crucial para discernir os papéis e os mecanismos moleculares básicos de um miRNA de interesse. Vários programas de predição de alvo de miRNA estão disponíveis para pesquisar possíveis interações de miRNA-mRNA. No entanto, a questão mais desafiadora é como validar genes alvo diretos de um miRNA de interesse. Este protocolo descreve uma estratégia reprodutível de métodos chaves em como identificar alvos de miRNA relativos à função de um miRNA. Este protocolo apresenta um guia prático em procedimentos passo a passo para descobrir níveis de miRNA, funções e mRNAs alvo relacionados usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real baseada em sonda (PCR), o ensaio de sulforhodamina B (SRB) após uma transfecção mímica de miRNA , geração da curva da dose-resposta, e ensaio do luciferase junto com a clonagem de 3 ' UTR de um gene, que seja necessário para a compreensão apropriada dos papéis de miRNAs individuais.
Introdução
MicroRNAs (miRNAs) são os pequenos RNAs regulatórios que modulam principalmente o processo de tradução e degradação de RNAs mensageiro (mRNAs), reagindo às 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) em genes alvo de boa-fé1. A expressão de miRNAs pode ser regulada por mecanismos transcricional e pós-transcricional. O desequilíbrio desses mecanismos reguladores traz níveis de expressão miRNAs descontrolados e distintos em inúmeras doenças, incluindo os cânceres2. Um único miRNA pode ter interações múltiplas com mRNAs diversos. Correspondentemente, um mRNA individual pode ser controlado por vários miRNAs. Portanto, as redes de s....
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Protocolo
1. maduro MicroRNA (miRNA) análise de expressão
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Síntese de DNA complementar maduro de miRNA (cDNA)
- Adicionar 254 ng de RNA total e 4,5 μL de misturas de desoxirribonuclease I (DNase I) e, em seguida, adicionar água ultrapura em tubos de tiras de PCR para fazer até 18 μL (Figura 2a). Prepare a reação para cada amostra de RNA total purificada de várias linhas celulares usando quantidade suficiente de misturas de DNase I com base no número total de reações.
Nota: As misturas de DNase I são compostas por DNase I (1,8 μL), inibidor da ribonuclease (0,3 μL) e 25 mM MgCl2 (2,4 ....
- Adicionar 254 ng de RNA total e 4,5 μL de misturas de desoxirribonuclease I (DNase I) e, em seguida, adicionar água ultrapura em tubos de tiras de PCR para fazer até 18 μL (Figura 2a). Prepare a reação para cada amostra de RNA total purificada de várias linhas celulares usando quantidade suficiente de misturas de DNase I com base no número total de reações.
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Resultados
A confirmação bem-sucedida e precisa dos níveis de miRNA é importante para a interpretação dos dados pelos quais a classificação de miRNAs é possível com base nos papéis esperados de miRNAs no desenvolvimento e progressão de uma doença. Os níveis de miRNA-107 e miRNA-301 foram medidos em três linhagens de células pancreáticas utilizando a PCR quantitativa baseada em sonda. A síntese de cDNAs de ambos um miRNA específico e um gene de referência na mesma reação pode aumentar a reprodutibilidade dos dados. Panc-1 e capan-1 .......
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Discussão
Estratégias para a determinação de alvos de miRNA de bona fide com as funções de um miRNA de interesse são indispensáveis para a compreensão de múltiplos papéis de miRNAs. A identificação de genes alvo de miRNA pode ser uma diretriz para interpretar os eventos de sinalização celular modulados por miRNAs em uma célula. Um desvelamento de genes-alvo funcionalmente importantes de miRNAs pode fornecer o conhecimento fundamental para desenvolver uma terapia baseada em miRNA no câncer.
Diversos méto.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo programa de pesquisa de ciência básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1D1A3B03035662); e fundo de pesquisa da Universidade Hallym, 2017 (HRF-201703-003).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo cônico de 15 mL | SPL Life Sciences | 50015 | |
| Placa de 24 poços | Thermo Scientific | 142475 | |
| Tubo cônico de 50 mL | SPL Life Sciences | 50050 | |
| Placa de 6 poços | Falcon | 353046 | |
| 6x Corante de carregamento de DNA | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| Tira de 8 tampas | Aplicado Biosystems | N8010535 | Para síntese de cDNA |
| Tira de 8 tubos | Applied Biosystems | N8010580 | Para síntese de cDNA |
| Placa de 96 poços | Falcon | 353072 | |
| Ácido acético | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Fosfatase alcalina | New England Biolabs | M0290S | 10.000 U/mL |
| de ampicilina | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tiras de tubos | Agilent Technologies | 401493 | Para PCR em tempo real |
| Sistema de PCR em tempo real AriaMx | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplificação, detecção e análise de dados |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10.000 unidades/mL |
| de células CAPAN-1 | ATCC | HTB-79 | |
| Capuz de cultura de células | Labtech | Modelo: LCB-1203B-A2 | |
| Câmaras de contagem com V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Contador de células |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentração |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| Bionics | DN30200 | 200 escada de DNA de preparação | |
| NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb escada | |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 unidades |
| Sistema de ensaio repórter de luciferase dupla | Promega | E1910 | 100 ensaios |
| Soro bovino fetal | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| de células competentes para HIT | Real Biotech Corporation (RBC) | RH617 | Células competentes |
| Células HPNE | ATCC | CRL-4023 | |
| LB caldo de ágar | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamina 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0,75 mL |
| Lipofectamina RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0,75 mL |
| Luminômetro | Promega | Modelo: E5311 | |
| Tubo de microcentrífuga | Eppendorf | 22431021 | |
| Leitor de microplacas | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control imita | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 imita | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (sistema de eletroforese) | TaKaRa | Modelo: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20.000 unidades/mL |
| Programa Oligo explorer | GeneLink | Para design de primer | |
| Tampas de tiras de tubos ópticos (8x Strip) | Agilent Technologies | 401425 | Para PCR em tempo real |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 células | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Tampão fosfato solução salina | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Miniprep de DNA plasmídeo S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polimerase | TaKaRa | R050A | 250 unidades |
| Shaker | TECAN | Plataforma de agitação | |
| Incubadora | de agitação Labtech | Modelo: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | Para geração de curva de dose-resposta | |
| Sulforrodamina B em pó | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Corante fluorescente de ligação para dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25.000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reações, sem AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (has-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | ID do ensaio: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| Ensaio de microRNA TaqMan (has-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | ID do ensaio: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| Kit TaqMan miR RT | Applied Biosystems | 4366597 | 1.000 reações |
| Incubadora Thermo CO2 (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 ° C e 5% CO2 incubação Ácido | |
| tricloroacético | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Base Trizma | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Água ultrapura | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti Termociclador de 96 poços | Applied Biosystems | Para amplificação de DNA (ou cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20.000 unidades/mL |
Referências
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Mole....
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Reimpressões e permissões
