Digital PCR-basert konkurransedyktig indeks for høy-produksjon analyse av Anvendelighet inne Salmonella
Summary
Dette molekylær-baserte tilnærmingen for å bestemme bakteriell fitness muliggjør presis og nøyaktig påvisning av mikroorganismer ved hjelp av unike genomisk DNA strekkoder som er kvantifisert via Digital PCR. Protokollen beskriver beregning av konkurransedyktige indeksen for Salmonella stammer; teknologien er imidlertid lett å tilpasse til protokoller som krever absolutt kvantifisering av genetisk formbare organisme.
Abstract
En konkurransedyktig indeks er en vanlig metode som brukes til å vurdere bakteriell fitness og/eller virulens. Nytten av denne tilnærmingen er et forbilde på dens letthet å utføre og dens evne til å standardisere egnethet av mange stammer til en vill-type organisme. Teknikken er begrenset, men av tilgjengelige fenotypiske markører og antall stammer som kan vurderes samtidig, noe som skaper behovet for et stort antall replikere eksperimenter. Samtidig med et stort antall eksperimenter, er arbeids-og materialkostnadene for kvantifisere bakterier basert på fenotypiske markører ikke ubetydelige. For å overvinne disse negative aspektene samtidig som de positive aspektene er beholdt, har vi utviklet en molekylær BAS ert tilnærming til direkte tall som kan kvantifisere mikroorganismer etter tekniske genetiske markører på bakteriell kromosomer. Unik, 25 base pair DNA strekkoder ble satt inn på en ufarlige geometrisk på kromosom av vill-type og mutant stammer av Salmonella. I vitro ble det utført konkurranse eksperimenter med inocula bestående av sammenslåtte stammer. Etter konkurransen ble de absolutte tallene for hver stamme kvantifisert ved hjelp av digital PCR, og de konkurrerende indeksene for hver stamme ble beregnet ut fra disse verdiene. Våre data tyder på at denne tilnærmingen til kvantifisere Salmonella er ekstremt følsom, nøyaktig og presis for å oppdage både svært rikelig (høy kondisjon) og sjeldne (lav fitness) mikroorganismer. I tillegg er denne teknikken lett tilpasses til nesten enhver organisme med kromosomer i stand til modifisering, samt til ulike eksperimentelle design som krever absolutt kvantifisering av mikroorganismer.
Introduction
Vurdering av fitness og virulens av patogene organismer er en grunnleggende del av mikrobiologi forskning. Det gjør at sammenligninger kan gjøres mellom stammer eller mellom muterte organismer, som gjør det mulig for forskere å fastslå viktigheten av visse gener under bestemte forhold. Tradisjonelt, virulens vurderingen utnytter en dyr modell av infeksjon benytter annerledes bakteriell belastninger og observerer utfallet av det infisert dyr (e.g. infeksjon dose50, dødelig dose50, tid å død, tegn alvorlighetsgrad, mangel på symptomer, etc.). Denne prosedyren gir verdifulle beskrivelser av virulens, men det krever belastninger for å forårsake betydelige forskjeller i utfall for å oppdage variasjoner fra vill-type. Videre resultatene er semi-kvantitative fordi mens sykdomsprogresjon og symptom alvorlighetsgrad kan subjektivt kvantifisert over tid, tolkning av virulens forhold til vill-type er mer kvalitativ (dvs. mer, mindre eller like kraftig). Et vanlig alternativ til å utføre dyre infectivity analyser er å generere konkurransedyktige indekser (CIs), verdier som direkte sammenligner fitness eller virulens av en belastning til en vill-type motstykke i en blandet infeksjon1. Denne teknikken har mange fordeler fremfor en tradisjonell dyremodell av smitte ved standardisering virulens til en vill-type belastning og bestemme en målbar verdi for å reflektere graden av demping. Denne teknikken kan også tilpasses til å analysere gen interaksjoner i bakterier ved å bestemme en kansellert ut konkurransedyktig indeks (COI)2. Ved å beregne en COI for en gruppe muterte organismer, kan forskerne avgjøre om to gener uavhengig bidrar til patogenesen, eller om de er involvert i samme virulens vei og er avhengig av hverandre. I tillegg beregner en CI krever opplisting av bakterier som kan gi verdifull innsikt i patogenesen av organismer. CIs og COIs også at forskere til esler avirulent stammer som ikke forårsaker klinisk sykdom, men fortsatt har forskjeller i fitness. Denne teknikken er begrenset ved bruk av tradisjonelle antibiotikaresistens markører for å identifisere stammer, og dermed begrense antall input stammer til bare én eller to om gangen. På grunn av denne begrensningen kreves det et stort antall eksperimentelle grupper og replikerer, som i tillegg til å legge til arbeids-og materialkostnader, også øker mulighetene for variasjon i eksperimentelle forhold og unøyaktige resultater. (For en grundig gjennomgang av fordelene og anvendelser av å bruke blandede infeksjoner å studere virulens, fitness, og gen interaksjoner, se C.R. Beuzón og D.W. Holden 1)
Forsøk har blitt gjort for å overvinne denne begrensningen, slik som bruk av fluorescensmerkete celler kvantifisert via Flow flowcytometri3,4,5. Denne teknikken kvantifiserer celler som bruker enten 1) merket antistoffer mot fenotypiske markører eller 2) endogenously produserte fluorescerende proteiner. Bruken av merket antistoffer har en grense for påvisning av 1 000 celler/mL, og krever derfor et høyt antall celler for å analysere3. Celler uttrykker fluorescerende proteiner har en endret fysiologi og er mottakelige for egnethet endringer som følge av høy protein uttrykk6. Begge metodene er begrenset av antall fluorescerende markører oppdages ved hjelp av Flow flowcytometri. En fremgang i molekylær kvantifisering ble oppnådd gjennom utvikling av en Microarray teknikk som oppdaget demping i 120 stammer fra en innledende blandet infeksjon på over 1 000 stammer i en murine modell7. Denne teknikken benyttet en Microarray analyse av RNA fra muterte stammer, noe som fører til betydelig variasjon i utfallet. Likevel etablerte det at store bassenger av blandede infeksjoner kan være et nyttig redskap, og at ved å benytte sensitive gjenkjennings teknikker, kan forskjeller i bakteriell virulens identifiseres. Med utviklingen av neste generasjons sekvensering, TN-SEQ utvidet nytten av Transposon mutasjoner, slik at en kraftig metode for kvantifisere bakterier som var tilfeldig mutert8,9,10, 11i. En alternativ protokollen ble nylig utviklet som eliminerer behovet for Transposons og i stedet bruker DNA strekkoder for lettere å identifisere og spore genomisk endringer og deres innvirkning på fitness12. Denne teknologien er en stor forfremmelse, men innsetting av genomisk strekkoder er fortsatt en tilfeldig prosess. For å overvinne tilfeldighet tidligere eksperimenter, Yoon et al. utviklet en metode for å beregne CIs av Salmonella stammer ved hjelp av unike DNA strekkoder satt inn på presise steder på kromosomer av bakterier13. Unike Barcoded stammer ble oppdaget ved hjelp av en qPCR-basert metode med SYBR grønn og primere spesifikke for hver unike strekkode. Teknikken var begrenset av begrensninger pålagt av qPCR, inkludert forskjeller i primer effektivitet og lav følsomhet, dokumentert av behovet for nestede-PCR før qPCR. Likevel viste denne tilnærmingen at målrettede genomisk modifikasjoner kan utnyttes for å oppdage og potensielt kvantifisere bassenger av flere bakterielle stammer.
I protokollen nedenfor beskriver vi en ny metodikk for å utføre bakterielle konkurranse eksperimenter med store bassenger med blandede inocula etterfulgt av nøyaktige kvantifisering ved hjelp av en svært følsom Digital PCR-teknikk. Protokollen innebærer genetisk merking bakteriell stammer med en unik DNA strekkode satt inn på en harmløs region av kromosom. Denne endringen gjør at stammer å være raskt og nøyaktig kvantifisert ved hjelp av moderne molekylær teknologi i stedet for tradisjonelle serielle fortynninger, kopi plating, og telling koloni forming enheter som er avhengige av fenotypiske markører (dvs. antibiotikaresistens ). Endringene tillater samtidig vurdering av mange stammer i en enkelt samlet inokulum, noe som reduserer muligheten for eksperimentell variasjon fordi alle stammer utsettes for nøyaktig de samme forholdene. Videre, mens denne teknikken ble utviklet i Salmonella enterica serovar tyfimurium, er det svært tilpasningsdyktig til genetisk formbare organisme og nesten alle eksperimentelle design der nøyaktig bakteriell teller er nødvendig, noe som gir en ny verktøy for å øke nøyaktigheten og gjennomstrømning i mikrobiologi laboratorier uten begrensninger pålagt av tidligere metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evnen til å nøyaktig kvantifisere mikroorganismer er av overordnet betydning for mikrobiologi forskning, og evnen til å nummerere unike stammer fra en innledende blandet befolkning har vist seg å være et uvurderlig verktøy for å vurdere fitness og virulens trekk i Bakterier. Men teknikkene for å oppnå dette har ikke kommet i takt med moderne utviklingen i molekylærbiologi. Teknologien for å enkelt endre kromosomer av mange bakterier, inkludert S. Tyfimurium, har vært tilgjengelig i nesten to ti år<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av George F. Haddix president ‘ s Faculty Research Fund og National Institute of General Medical Science av National Institutes of Health (NIH) under tildeling nummer GM103427. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
Referências
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
