विनियामक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन ्स्स्स के लिए बाइंडिंग साइट्स की पहचान करने के लिए अनुक्रम स्थान की खोज
Summary
अनुक्रम विशिष्टता जीन विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है. नियामक प्रोटीन है कि विशिष्ट दृश्यों को पहचान जीन विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं. ऐसे प्रोटीन के लिए कार्यात्मक बाध्यकारी साइटों को परिभाषित करना एक चुनौतीपूर्ण जैविक समस्या है। आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के लिए बाइंडिंग साइट की पहचान के लिए एक पुनरावर्ती दृष्टिकोण का वर्णन यहाँ किया गया है और यह सभी आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीनों पर लागू होता है।
Abstract
जीन विनियमन सभी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. ट्रांसक्रिप्शनल, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल (या आरएनए प्रोसेसिंग), ट्रांसलेशनल, और पोस्ट-ट्रांसलेशनल स्टेप्स का उपयोग विशिष्ट जीनों को विनियमित करने के लिए किया जाता है। अनुक्रम-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन स्थानिक या अस्थायी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए विशिष्ट दृश्यों को लक्षित करते हैं। न्यूक्लिक एसिड में बाध्यकारी साइटों आम तौर पर उत्परिवर्तन विश्लेषण की विशेषता है. हालांकि, ब्याज की कई प्रोटीन ऐसी विशेषता के लिए कोई ज्ञात बाध्यकारी साइट है. यहाँ हम आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए पहले से अज्ञात बाध्यकारी साइटों की पहचान करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन. यह पुनरावर्ती चयन और एक यादृच्छिक अनुक्रम पूल के साथ शुरू दृश्यों के प्रवर्धन शामिल है. इन चरणों-ट्रांसक्रिप्शन, बाइंडिंग, और प्रवर्धन के कई दौरों के बाद समृद्ध अनुक्रम एक पसंदीदा बाइंडिंग साइट (ओं) की पहचान करने के लिए अनुक्रम हैं। इस दृष्टिकोण की सफलता इन विट्रो बाइंडिंग परख का उपयोग कर नजर रखी है. बाद में, इन विट्रो और विवो कार्यात्मक परख में चयनित दृश्यों की जैविक प्रासंगिकता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की पहचान और किसी भी आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक पहले से अज्ञात बाध्यकारी साइट (ओं) की विशेषता की अनुमति देता है जिसके लिए एक परख प्रोटीन बाध्य और असीमित RNAs अलग मौजूद है.
Introduction
कोशिका जीव विज्ञान में, जीन विनियमन एक केंद्रीय भूमिका निभाता है. जीन अभिव्यक्ति मार्ग के साथ एक या कई चरणों में, जीन को विनियमित करने की क्षमता है. इन चरणों में प्रतिलेखन (प्रारंभ, दीर्घीकरण, और समाप्ति) के साथ-साथ स्पेलिंग, पॉलीएडेनिएशन या 3′ अंत गठन, आरएनए निर्यात, एमआरएनए अनुवाद, और प्राथमिक प्रतिलिपि के क्षय/स्थानीकरण शामिल हैं। इन चरणों में, न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन जीन विनियमन modulate. ऐसे प्रोटीन के लिए बाध्यकारी स्थलों की पहचान जीन नियंत्रण के अध्ययन का एक महत्वपूर्ण पहलू है। उत्परिवर्तनी विश्लेषण और जातिवृत् तीय अनुक्रम तुलना का उपयोग न्यूक्लिक अम्लों में नियामक अनुक्रमों या प्रोटीन-बाइंडिंग स्थलों की खोज करने के लिए किया गया है, जैसे प्रमोटर, जोड़ साइटें, पॉलीडेनिएनेशन तत्व, और अनुवादात्मक संकेत1, २ , 3 , 4.
पूर्व MRNA splicing जीन अभिव्यक्ति और विनियमन के दौरान एक अभिन्न कदम है. स्तनधारी जीनों के अधिकांश जीन, जिनमें मनुष्य भी शामिल हैं, में अंतर्ओं है। इन प्रतिलिपियों का एक बड़ा अंश वैकल्पिक रूप से spliced है, एक ही जीन या प्राथमिक प्रतिलिपि से कई MRNA और प्रोटीन isoforms का उत्पादन. इन आइसोफॉर्म्स में सेल जीव विज्ञान में कोशिका-विशिष्ट और विकासात्मक भूमिकाएं होती हैं। 5′ जोड़ साइट, शाखा बिंदु, और polypyrimidine-tract/3′ जोड़ साइट महत्वपूर्ण splicing संकेत है कि विनियमन के अधीन हैं. नकारात्मक विनियमन में, एक अन्यथा मजबूत जोड़ साइट दमित है, जबकि सकारात्मक विनियमन में एक अन्यथा कमजोर जोड़ साइट सक्रिय है. इन घटनाओं का एक संयोजन कार्यात्मक अलग आइसोफॉर्म्स की एक बहुतायत पैदा करता है। आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन इन वैकल्पिक splicing घटनाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं.
अनेक प्रोटीन ज्ञात होते हैं जिनके बंधनस्थल या आरएनए लक्ष्य ों की पहचान5,6होती है . नियामक प्रोटीन को उनके डाउनस्ट्रीम जैविक लक्ष्यों या दृश्यों से जोड़ना अक्सर एक जटिल प्रक्रिया है। ऐसे प्रोटीन के लिए, उनके लक्ष्य आरएनए या बाध्यकारी स्थल की पहचान उनके जैविक कार्यों को परिभाषित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। एक बार एक बाध्यकारी साइट की पहचान की है, यह आगे मानक आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण का उपयोग कर विशेषता जा सकता है.
यहाँ वर्णित दृष्टिकोण दो फायदे हैं. सबसे पहले, यह ब्याज की एक प्रोटीन के लिए एक पहले से अज्ञात बाध्यकारी साइट की पहचान कर सकते हैं. दूसरा, इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह एक साथ संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है, जो अन्यथा श्रम गहन बाध्यकारी साइट के भीतर अनुक्रम आवश्यकताओं के बारे में तुलनीय जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जाएगा. इस प्रकार, यह आरएनए में प्रोटीन बाइंडिंग साइटों की पहचान करने के लिए एक तेज, आसान और कम महंगा उपकरण प्रदान करता है। मूल रूप से, इस दृष्टिकोण (सेलेक्स या EXponential संवर्धन द्वारा Ligands के व्यवस्थित विकास) बैक्टीरियोफेज T4 डीएनए पॉलिमरेज (जीन 43 प्रोटीन) के लिए बाध्यकारी साइट की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो अपने MRNA में ribosome बाध्यकारी साइट के साथ ओवरलैप. बाइंडिंग साइट विश्लेषण7के लिए 65,536 यादृच्छिक वेरिएंट का प्रतिनिधित्व करने वाले एक 8-आधार लूप अनुक्रम है। दूसरा, दृष्टिकोण भी स्वतंत्र रूप से दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि विशिष्ट बाइंडिंग साइटों या विभिन्न रंगों के लिए aptamers लगभग 1013 दृश्यों8के एक पूल से चुना जा सकता है. वास्तव में, इस दृष्टिकोण का व्यापक रूप से कई अलग-अलग संदर्भों में उपयोग किया गया है ताकि कई लिगन्डों, जैसे प्रोटीन, छोटे अणुओं, और कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए aptamers (RNA या DNA अनुक्रमों) की पहचान की जा सके, और उत्प्रेरक9के लिए। एक उदाहरण के रूप में, एक aptamer दो जिंक डेरिवेटिव, कैफीन और theophylline के बीच भेदभाव कर सकते हैं, जो कैफीन में एक मिथाइल समूह की उपस्थिति से अलग10. हम बड़े पैमाने पर इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है (SELEX या पुनरावृत्तचयन-प्रवर्धन) अध्ययन करने के लिए कैसे आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन splicing या splicing विनियमन11में कार्य करते हैं, जो नीचे चर्चा के लिए आधार होगा.
यादृच्छिक पुस्तकालय: हम 31 न्यूक्लियोटाइड्स की एक यादृच्छिक पुस्तकालय का इस्तेमाल किया. यादृच्छिक पुस्तकालय के लिए लंबाई विचार ढीला विचार है कि सामान्य splicing कारक U2AF65 शाखा बिंदु अनुक्रम और 3′ splice साइट के बीच एक अनुक्रम के लिए बाइंड कर देता है पर आधारित था. औसत पर, मेटाज़ोअन में इन स्पेलिंग संकेतों के बीच रिक्ति 20 से 40 न्यूक्लिओटाइड की श्रेणी में है। एक और प्रोटीन सेक्स-घातक अपने लक्ष्य पूर्व mRNA, ट्रांसफार्मरके 3′ splice साइट के पास एक खराब विशेषता नियामक अनुक्रम के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता था। इस प्रकार, हम 31 न्यूक्लिओटाइड के एक यादृच्छिक क्षेत्र चुना, प्रतिबंध एंजाइम साइटों के साथ प्राइमर बाध्यकारी साइटों द्वारा flanked पीसीआर प्रवर्धन और T7 आरएनए बहुलक प्रवर्तक के लगाव के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए अनुमति देते हैं. सैद्धांतिक पुस्तकालय का आकार या जटिलता 431 या लगभग 1018थी . हमने नीचे वर्णित प्रयोगों के लिए अपने यादृच्छिक आरएनए पूल ($1012-1015)को तैयार करने के लिए इस पुस्तकालय के एक छोटे से अंश का उपयोग किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी प्रोटीन पशु और संयंत्र के विकास के महत्वपूर्ण नियामकों रहे हैं. SELEX प्रक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता एक परख है कि प्रोटीन बाध्य और असीम आरएनए भिन्नों को अलग करने के लिए ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पिछले धन के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों धन्यवाद.
Materials
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
Referências
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3′ end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. , (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667 (2013).
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).
