Utforske sekvens plass til å identifisere bindende områder for regulatoriske RNA-binding proteiner

Summary

Sekvens spesifisitet er avgjørende for gen regulering. Regulatoriske proteiner som gjenkjenner spesifikke sekvenser er viktig for gen regulering. Definere funksjonelle bindende områder for slike proteiner er et utfordrende biologisk problem. En gjentakende tilnærming for identifisering av et bindings sted for et RNA-bindende protein er beskrevet her, og gjelder for alle RNA-bindende proteiner.

Abstract

Gen regulering spiller en viktig rolle i alle celler. Transcriptional, post-Transcriptional (eller RNA prosessering), translational, og post-translational trinn brukes til å regulere spesifikke gener. Sekvens spesifikke nukleinsyre yre-bindende proteiner mål bestemte sekvenser for å kontrollere romlige eller timelige genuttrykk. Innbindingen steder inne nukleinsyre syren er karakteristisk kjennetegnet av mutational analyse. Men mange proteiner av interesse har ingen kjent bindende nettsted for slik karakterisering. Her beskriver vi en metode for å identifisere tidligere ukjente bindings områder for RNA-bindende proteiner. Det innebærer gjentakende valg og forsterkning av sekvenser som starter med et randomisert sekvens utvalg. Etter flere runder med disse trinnene-transkripsjon, binding, og forsterkning-de beriket sekvenser er sekvensielt å identifisere en foretrukket bindende område (r). Suksessen til denne tilnærmingen er overvåket ved hjelp in vitro bindende analyser. Deretter kan in vitro og in vivo funksjonelle analyser brukes til å vurdere den biologiske relevansen til de valgte sekvensene. Denne tilnærmingen tillater identifisering og karakterisering av et tidligere ukjent bindende nettsted (er) for ethvert RNA-bindende protein som en analyse for å skille protein-bundet og ubundet RNAs eksisterer.

Introduction

I cellebiologi spiller gen regulering en sentral rolle. På ett eller flere trinn langs genuttrykk veien, har gener potensial til å bli regulert. Disse trinnene inkluderer transkripsjon (initiering, forlengelse, og oppsigelse) samt skjøting, polyadenylation eller 3 ‘ end formasjon, RNA eksport, mRNA oversettelse, og forfall/lokalisering av primære transkripsjoner. På disse trinnene, nukleinsyre acid-bindende proteiner modulere gen regulering. Identifisering av bindende områder for slike proteiner er et viktig aspekt ved å studere gen kontroll. Mutational analyse og Fylogenetiske sekvens sammenligning har blitt brukt til å oppdage regulatoriske sekvenser eller protein-bindende steder i nukleinsyre syrer, slik som arrangører, skjøte steder, polyadenylation elementer, og translational signaler^{1, 2} andre priser ^{, 3} andre priser ^{, fire}til.

Pre-mRNA skjøting er en integrert trinn under genuttrykk og regulering. Flertallet av pattedyr gener, inkludert de hos mennesker, har introns. En stor brøkdel av disse transkripsjoner er alternativt skjøtes, produsere flere mRNA og protein isoformene fra samme genet eller primære transkripsjon. Disse isoformene har celle-spesifikke og utviklingsmessige roller i cellebiologi. Den 5 ‘ skjøte området, den grenen-punktet, og polypyrimidine-tarmkanalen/3 ‘ skjøte området er kritiske skjøting signaler som er underlagt regulering. I negativ regulering, en ellers sterk skjøte området er undertrykt, mens i positiv regulering en ellers svak skjøte nettstedet er aktivert. En kombinasjon av disse hendelsene gir en overflod av funksjonelt distinkte isoformene. RNA-bindende proteiner spiller nøkkelroller i disse alternative skjøting hendelser.

Tallrike proteiner er kjent hvis bindings sted (er) eller RNA-mål gjenstår å identifiseres som^5,6. Linking regulatoriske proteiner til deres nedstrøms biologiske mål eller sekvenser er ofte en kompleks prosess. For slike proteiner, identifisering av deres mål RNA eller bindende nettsted er et viktig skritt i å definere sine biologiske funksjoner. Når et bindende nettsted er identifisert, kan det videre karakteriseres ved hjelp av standard molekylær-og biokjemiske analyser.

Tilnærmingen er beskrevet her har to fordeler. For det første kan det identifisere et tidligere ukjent bindings område for et protein av interesse. For det andre er en ekstra fordel med denne tilnærmingen at den samtidig tillater metnings mutagenese, som ellers ville være arbeidsintensiv for å få sammenlignbar informasjon om sekvens krav innenfor bindings området. Dermed tilbyr det en raskere, enklere og mindre kostbart verktøy for å identifisere protein bindende områder i RNA. Opprinnelig ble denne tilnærmingen (SELEX eller systematisk evolusjon av ligander ved eksponentiell berikelse) brukt til å karakterisere bindings stedet for bakteriofag T4 DNA-polymerase (genet 43 protein), som overlapper med ribosom bindings sted i sin egen mRNA. Bindings området inneholder en 8-base løkke sekvens som representerer 65 536 randomiserte varianter for analyse⁷. For det andre var tilnærmingen også selvstendig brukes til å vise at bestemte bindende nettsteder eller aptamers for ulike fargestoffer kan velges fra en pool av ca 10¹³ sekvenser⁸. Faktisk har denne tilnærmingen blitt bredt brukt i mange forskjellige sammenhenger for å identifisere aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) for å binde mange ligander, slik som proteiner, små molekyler og celler, og for katalyse⁹. Som et eksempel kan en aptamer diskriminere mellom to xantin derivater, koffein og teofyllin, som avviker ved tilstedeværelsen av en methyl gruppe i koffein¹⁰. Vi har mye brukt denne tilnærmingen (SELEX eller gjentakende utvalg-forsterkning) for å studere hvordan RNA-binding proteiner fungerer i skjøting eller skjøting regulering¹¹, som vil være grunnlaget for diskusjonen nedenfor.

Den tilfeldige biblioteket: vi brukte et tilfeldig bibliotek med 31 nukleotider. Lengden hensynet til tilfeldige biblioteket var løst basert på ideen om at den generelle skjøting faktor U2AF⁶⁵ binder seg til en sekvens mellom gren-punktet sekvens og 3 ‘ skjøte området. I gjennomsnitt er avstanden mellom disse skjøting signalene i Metazoer i størrelsesklasse 20 til 40 nukleotider. En annen protein sex-lethal var kjent for å binde seg til en dårlig preget regulatoriske sekvensen nær 3 ‘ skjøte stedet for sitt mål pre-mRNA, transformator. Derfor valgte vi en tilfeldig region av 31 nukleotider, flankert av primer bindende områder med begrensning enzym områder for å muliggjøre PCR forsterkning og feste av T7 RNA polymerase promoter for in vitro transkripsjon. Den teoretiske biblioteket størrelse eller kompleksitet var 4³¹ eller ca 10¹⁸. Vi brukte en liten brøkdel av dette biblioteket for å forberede våre tilfeldige RNA Pool (~ 10¹²-10¹⁵) for eksperimentene beskrevet nedenfor.

Protocol

Merk: figur 1 inneholder et sammendrag av de viktigste trinnene i prosessen med gjentatt valg-forsterkning (SELEX). 1. generering av en tilfeldig biblioteksmal Syntetisere fremover primer 5 ‘- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3 ‘ og omvendt PRIMER 5 ‘-GCGACGGATCCAAGCTTca-3 ‘ av kjemisk syntese på en DNA-synthesizer.Merk: den primere og det tilfeldige biblioteket kan være syntetisert kommersielt. Syntetisere et tilfeldig…

Representative Results

Følgende observasjoner viser vellykket valg-forsterkning (SELEX). Først analyserte vi Pool 0 og de valgte sekvensene for binding til proteinet som brukes for den gjentakende markeringen-forsterknings tilnærmingen. Figur 2 viser at pattedyr polypyrimidine-tarmkanalen bindende PROTEIN (PTB) viser knapt synlig binding til bassenget 0 sekvensen, men høy affinitet for den valgte sekvensen bassenget. Det var knapt synlig binding til pool 0 når vi brukte ca 300…

Discussion

Nukleinsyre acid-bindende proteiner er viktige regulatorer av dyre-og plante utvikling. Et viktig krav for SELEX prosedyren er utviklingen av en analyse som kan brukes til å skille protein-bundet og ubundet RNA fraksjoner. I prinsippet kan denne analysen være en in vitro bindende analysen som filter-bindende analysen, gel mobilitet Shift-analysen, eller en matrise bindende analysen¹⁹ for rekombinant proteiner, renset proteiner, eller protein komplekser. Analysen kan også være en enzymatisk ana…

Materials

Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard