一种冷冻-解冻方法，用于制备奇托桑-波里（乙烯基酒精）水凝胶，无交联剂和二分释放研究

Summary

冷冻解冻法用于生产无交联剂的甲苯-聚（乙烯醇）水凝胶。对于此方法，必须考虑冻结条件（温度、周期数）和聚合物比，这可能会影响获得的水凝胶的性能和应用。

Abstract

赤酸多聚（乙烯醇）水凝胶可以通过冷冻解冻方法生产，而无需使用有毒交联剂。这些系统的应用受到其特性（例如孔隙度、灵活性、膨胀能力、药物装载和药物释放能力）的限制，这些特性取决于冻结条件以及聚合物的种类和比例。该协议描述了如何在聚合物成分的50/50 w/w%下制备来自甲酸和聚物（乙烯基醇）的水凝胶，并改变冷冻温度（-4°C，-20°C，-80°C）和冷冻解冻周期（4，5，6冷冻周期）。获得了FT-IR光谱、SEM显微图和水凝胶孔隙学数据。此外，还评估了二丁二药的膨胀能力和药物负荷和释放。SEM显微图和孔隙学的结果表明，孔隙尺寸减小，而孔隙度在较低温度下增加。在轻微的冰冻温度下，肿胀百分比较高。研究了水凝胶中二氧化二的释放。所有网络保持药物释放30小时，并已观察到，一个简单的扩散机制调节二次释放根据Korsmeyer-Peppas和Higuchi模型。

Introduction

近年来，水凝胶在生物医学领域引起了极大的兴趣，因为它们是三维网络，含水量高，柔软灵活^{，因此很容易}模仿天然组织。此外，它们不会在生理温度和pH下溶解在水介质中，但存在大肿胀^2。水凝胶可以作为组织工程支架、卫生用品、隐形眼镜和伤口敷料;因为它们可以捕获和释放活性化合物和药物，它们被用作药物输送系统^3。根据其应用，水凝胶可以由天然或合成聚合物制成，或两者兼而有之，以获得最佳特性^4。

水凝胶的特性是许多物理和化学因素的结果。在物理层面上，它们的结构和形态取决于它们的孔隙度、孔径和孔隙分布^5。在化学和分子水平上，聚合物类型、聚合物链中的亲水组含量、交联点类型和交联密度是决定膨胀能力和机械性能^{的因素6、7。}

根据形成网络的交联剂的类型，水凝胶被归类为化学水凝胶或物理水凝胶。化学水凝胶由其链之间的共价相互作用连接，通过紫外线和伽马辐照或使用交联剂^7，8形成。化学水凝胶通常具有强和耐受性，但一般来说，交联剂对细胞有毒，其去除难度大，因此应用有限。另一方面，物理水凝胶通过非共价相互作用与聚合物链的连接形成，避免使用交联剂^4、9。网络中的主要非共价相互作用是疏水性相互作用、静电力、互补和氢边界^7。

聚（乙烯醇）（PVA，图1a）是一种合成和水溶性聚合物，具有优异的机械性能和生物相容性，可以通过无冻融剂水凝胶通过冷冻解冻方法^10、11。这种聚合物在冻结¹²时，能够在其链的-OH组（晶体区）之间形成氢键的集中区。这些晶体区作为网络中的交联点，由两个事件促进：当晶体水膨胀时聚合物链的接近和PVA在冻结¹³期间从等位化到合成性PVA的变化。由于冷冻干燥，水晶体被升华，留下空隙，即水凝胶¹⁴的孔隙。为了获得性能更好的水凝胶，PVA 可以很容易地与其他聚合物结合使用。

从这个意义上说，甲氧基是一种选择，因为它是天然来源中唯一具有正电荷的生物聚合物。它通过甲壳素的脱氧乙酰化获得，它由β-1，4链接D-葡萄糖胺（脱乙酰化单位）和N-乙酰D-葡萄糖胺（乙酰化单位）^的随机组合组成（图1b）。基托桑是可生物降解的人类酶，它是生物相容性。此外，由于其阳离子性质，它可以与细胞表面的负电荷相互作用，并且这个特性已经与其抗菌活性¹⁷相关。这种聚合物易于加工;然而，它们的机械性能是不够的，一些材料被添加成具有更好特性的复合物。

考虑到甲酸和PVA的具体特性，通过冷冻解冻方法^2、18成功地制造了水凝胶，避免了有毒交联剂的使用。在甲酸-PVA水凝胶中，也形成PVA的结晶区，并相互渗透，与PVA中的_-NH2组和-OH组形成简单的氢键。最终甲酸-PVA水凝胶机械稳定，高膨胀率和低毒性，具有抗菌效果^18。但是，根据制备中使用的冻结条件（温度、时间和周期数），最终特征可能会发生变化。一些研究报告说，增加冷冻周期的数量减少肿胀程度，增加拉伸强度^19，20。为了加强网络，其他制剂，如伽马和紫外线辐射和化学交联剂已额外使用冷冻解冻制剂21，22，23。具有较高甲酸比例的氢凝胶具有较多的孔网络和高膨胀能力，但强度和热稳定性较低。在这方面，必须考虑制备条件，以获得适合其目标应用的水凝胶。

这项工作的目的是详细介绍冻结条件（冻结温度和周期数）如何影响CS-PVA水凝胶的最终特性。评估了FT-IR光谱、形态和孔隙特性和膨胀能力，以及药物装载和释放能力。在释放研究中，由于其大小适合水凝胶结构，因此用作模型药物（图1c）。

Protocol

1. 甲酸-PVA水凝胶的制备 准备 2% （w/w） 千叶和 10% （w/w） PVA 解决方案。在室温下将0.2克甲釜醇溶解在10mL的0.1M CH3COOH溶液（以前过滤）中，并在一夜之间保持连续的机械搅拌。将1克PVA溶解在10 mL蒸馏水中，在80°C搅拌1小时。 使用磁性搅拌器将两种溶液1：1混合，直到在室温下均匀，并将混合物倒在培养皿上。将样品在大气压力下离开2小时，以脱气。 将水凝胶冷冻至…

Representative Results

水凝胶制备在-4°C、-20°C和-80°C下获得基托桑-PVA水凝胶，4个冷冻周期，在-80°C，通过先前报告的冷冻解冻方法2，在-80°C下获得5和6个冷冻周期。所有水凝胶均质、半透明、灵活且耐操作。 FT-IR 特性FT-IR光谱如图2所示。检测到七种基托桑和PVA聚合物的特征?…

Discussion

冷冻解冻方法是一种合适的工艺，用于制备生物相容性水凝胶，主要应用于生物医学、制药或化妆品应用34、35、36。与其他众所周知的制备水凝胶的方法相比，这种方法最重要的优点是避免使用交联剂，这可能导致炎症反应或对人体产生不良影响^34。这是一种通用的方法，因为它提供了从PVA或其混合物中制备?…

Materials

Materials:
Chitosan medium molecular weight	Sigma-Aldrich	448877	Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid)	Merck
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	1005706
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	341584	Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator	Telstar
Falcon tubes	Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy	Nicolet iS50	in ATR mode
Lyophilizator	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
Scanning electron microscope	Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer	Agilent 8453