EVOLVER Framework muliggør kontinuerlig mikrobiel kultur med høj opløsning og dynamisk kontrol over eksperimentelle parametre. Denne protokol demonstrerer, hvordan systemet kan anvendes til at gennemføre et komplekst fitness eksperiment, der vejleder brugerne om programmering af automatiseret kontrol over mange individuelle kulturer, måling, indsamling og interaktion med eksperimentelle data i realtid.
Kontinuerlige dyrkningsmetoder gør det muligt at udvikle celler under kvantitativt kontrollerede miljøforhold, og er derfor stort set nyttige til måling af fitness fænotyper og forbedring af vores forståelse af, hvordan genotyper formes ved selektion. Omfattende nylige bestræbelser på at udvikle og anvende niche kontinuerlig kultur enheder har afsløret fordelene ved at gennemføre nye former for cellekultur kontrol. Dette omfatter at definere brugerdefinerede selektions tryk og øge gennemløb for undersøgelser, der spænder fra langsigtet eksperimentel evolution til genomdækkende Biblioteks valg og karakterisering af syntetisk genkredsløb. EVOLVER platformen blev for nylig udviklet til at imødekomme denne stigende efterspørgsel: en kontinuerlig kultur platform med en høj grad af skalerbarhed, fleksibilitet og automatisering. eVOLVER giver en enkelt standardisering platform, der kan (re)-konfigureret og skaleret med minimal indsats for at udføre mange forskellige typer af høj-gennemløb eller multi-dimensionelle vækst udvælgelse eksperimenter. Her er en protokol præsenteret for at give brugerne af eVOLVER Framework en beskrivelse til konfiguration af systemet til at gennemføre en brugerdefineret, storstilet kontinuerlig vækst eksperiment. Specifikt, protokollen guider brugere om, hvordan man programmere systemet til multiplex to selektions tryk-temperatur og osmolaritet-på tværs af mange eVOLVER hætteglas med henblik på at kvantificere fitness landskaber af Saccharomyces cerevisiae mutanter ved fine Opløsning. Vi viser, hvordan enheden kan konfigureres både programmatisk, via sin open source web-baseret software, og fysisk, ved at arrangere Fluidic og hardware layouts. Processen med fysisk opsætning af enheden, programmering af kulturen rutine, overvågning og interagere med eksperimentet i realtid over internettet, prøvetagning hætteglas til efterfølgende offline analyse, og post eksperimentdata analyse er detaljerede. Dette bør tjene som udgangspunkt for forskere på tværs af forskellige discipliner til at anvende eVOLVER i udformningen af deres egne komplekse og højt gennemløb cellevækst eksperimenter til at studere og manipulere biologiske systemer.
Kontinuerlig cellekultur teknikker, først udviklet næsten 70 år siden1,2, nyder en nylig genoplivning3,4. Dette skyldes en sammen løb af faktorer. For det første har udviklingen af en høj dataoverførselsteknik, som har gjort det muligt at oplæse og generere et stort antal genotyper5,6, skabt en samtidig efterspørgsel efter forsøgsteknikker, der letter velkontrolleret cellevækst og fænotypning. Til dette formål er kontinuerlig kultur en kraftfuld eksperimenterende tilgang til at udnytte de opståede genomiske fremskridt. Ved at fremme vækst valg/eksperimenter på cellulære populationer i præcist kontrollerede (og dynamiske) miljøforhold giver kontinuerlig kultur et middel til nøje at kortlægge genotyper til fænotyper7,8, kvantitativt karakterisere manipuleret stammer og organismer9, og spore adaptive genetiske ændringer i laboratoriet Evolution undersøgelser10,11,12.
For det andet har den nylige fremkomsten af tilgængelige prototyping teknikker, såsom additiv fremstilling og open source hardware og softwareelementer, gjort det muligt for en bredere kreds af brugere at designe og opbygge deres egne omkostningseffektive former for kontinuerlige kultur systemer direkte i laboratoriet. Alt dette har ført til en spændende vifte af gør-det-selv (DIY) enheder, der udfører kontinuerlig kultur funktionaliteter, såsom chemostat13, turbidostat14, eller morbidostat15. Desværre, selv om det lykkedes at løse specifikke (niche) problemer, som de blev designet, disse ad hoc-løsninger generelt mangler evnen til at skalere i gennemløb og/eller eksperimentel design kompleksitet.
EVOLVER-systemet blev designet med det formål at skabe en enkelt platform, der kan imødekomme de voksende eksperimentelle behov i kontinuerlig kultur og matche hastigheden og omfanget af emergent genomiske teknikker16 (figur 1a). Evolver’s design implementerer fælles principper, der underliggende meget skalerbare teknologier fra andre discipliner17, herunder standardiserede fodspor, modulære komponenter og open-source design. Således, løsninger til nye niche applikationer kan designes uden større ændringer i systemet. EVOLVER, der består af meget modulære og open source-wetware, hardware, elektronik og webbaseret software, er det første automatiserede kontinuerlige kultur system, der kan være omkostningseffektivt og let re-konfigureret til at udføre stort set alle typer vækst eksperiment med høj hastighed. Gennem modulære og programmerbare Smart ærmer, som huset alle de sensorer og aktuatorer er nødvendige for at styre de enkelte kulturer, eVOLVER unikt muliggør skalering af både gennemløb og individuel kontrol af kulturforhold. Som en webbaseret platform udveksler eVOLVER desuden data og oplysninger med fjerncomputere i realtid, hvilket muliggør samtidig overvågning af hundredvis af individuelle kulturer og automatiserede kultur forstyrrelser gennem vilkårligt definerede kontrol Algoritmer.
I tidligere arbejde16, blev evolvers robuste præstation demonstreret i langsigtede eksperimenter over hundredvis af timers drift, og dens evne til at dyrke forskellige organismer, fra E. coli og s. cerevisiae til uomesticerede Mikrober. Der blev udført en række forskellige eksperimenter med vækst udvælgelse, hvor der blev anvendt programmeringsmæssigt definerede multidimensionale udvælgelses gradienter på tværs af en række individuelle kulturforhold, og de resulterende cellulære fitness landskaber blev Kvantificerede. Her er målet at give eVOLVER brugere med en beskrivelse af, hvordan man bruger systemet til at designe og disse typer af eksperimenter. Som et illustrativt eksempel, metoder kvantificerer fitness landskab af S. cerevisiae mutanter på tværs af en to-dimensionelle miljømæssige gradient består af temperatur og osmotisk stress præsenteres. Protokollen guider brugerne gennem konfiguration af eVOLVER Framework for dette eksperiment både programmatisk, i at bruge softwaren til at indstille tilpassede Turbiditet og temperaturkontrol rutiner for hver af 16 parallelle kontinuerlige kulturer, og fysisk, gennem fluidics-layoutet til passende rute medier med forskellige saltkoncentrationer. Denne protokol bør tjene som en generel rubrik for at konfigurere eVOLVER til at udføre en bred vifte af automatiserede kontinuerlig kultur eksperimenter for forskellige undersøgelser og discipliner.
Vækst udvælgelse er et uundværligt redskab i biologi, der stort set anvendes til at generere og karakterisere fænotypiske forskelle mellem cellulære populationer. Mens batch kulturer tillader vækst udvælgelse i en begrænset måde, kontinuerlig kultur teknikker dramatisk udvide graden af kontrol og forudsigelighed af disse eksperimenter, ved at udøve præcis regulering over formen og dynamikken i udvælgelsen til at generere gentagelige, kvantitative resultater22. Der er blevet anvendt kontinuerlig kultur til streng kontrol af udvælgelsen af biblioteker med stor mangfoldighed20,23,24,25og til gennemførelse af sofistikerede tilpasningsordninger i forsøgs-og instrueret Evolution11,12,26,27. Kontinuerlig kultur giver også mulighed for præcis karakterisering af celler på tværs af en række kvantitativt kontrollerede forhold for bedre at forstå komplekse genetiske systemer og optimere konstruerede bioproduktion stammer9,14 , af 28.
Men der er ingen universel protokol for kontinuerlig kultur, da subtile ændringer af de selektive betingelser kan føre til dramatiske ændringer i biologiske resultater4,29,30. Experimenters skal kunne vælge mellem udvælgelses ordninger og tilpasse forsøgsprotokoller og udstyr i overensstemmelse hermed. Ud over at tilbyde et valg mellem kontrolparametre, ville sådanne systemer ideelt set være sofistikeret nok til selvstændigt at forvalte flere parametre samtidig i meget parallelle eksperimenter, der er nødvendige for at dechifrere interagerende input i komplekse biologiske systemer (f. eks. epistasis). eVOLVER adresserer denne udfordring ved at give brugerne mulighed for vilkårligt at programmere feedback-kontrol mellem kulturforhold og Fluidic-funktioner med henblik på at specificere højt specialiserede miljø nicher.
For at overvinde begrænsningerne i den aktuelle opsætning og udvide eller ændre kontrolparametre, kan Smart ærmet nemt redesignet til at tilføje nye sensorer eller aktuatorer. Desuden vil en reduktion af hætteglas volumen reducere medie udgifter, som kan være betydelige i kontinuerlig kultur. Mens den nuværende konstruktion tillader måling og kontrol af temperatur, kultur agitation, lys induktion, turbiditet, og fluidics, andre parametre skal måles eksternt ved prøveudtagning fra hætteglassene. Det nuværende arbejde omfatter at indarbejde evnen til at overvåge enzymatisk aktivitet via luciferase og regulere opløst ilt og pH direkte i eVOLVER kulturer. Derudover, selvom det ikke påvises i dette arbejde, kan eVOLVER interface med nye millifluidic multiplexing enheder16 , der trækker på principperne om storstilet integration (stammer fra elektronik og vedtaget af microfluidics) for at Det er billigt at aktivere mere kompleks Fluidic-håndtering (f. eks. multipleks Fluidic-indgange, hætteglas-til-hætteglas-overførsler). Disse wetware moduler kan designes og fremstilles helt i laboratoriet, hvilket giver brugerne mulighed for at dirigere væsker ved programmeringsmæssigt at aktivere forskellige kombinationer af ventiler i automatiserede Fluidic rutiner. Dette giver brugerne mulighed for at overvinde de stive Fluidic designs, der traditionelt anvendes i kontinuerlig kultur, men også at skalere Fluidic kapaciteter til høj-gennemløb med et mindre antal dyrekontrol elementer (f. eks peristaltiske pumper). Endelig, vi håber at indarbejde en autosampling platform, som vil udnytte disse Milli fluidics og DIY komponenter, overvinde begrænsningen af manuel interaktion under længere og større eksperimenter, hvor prøvetagning kulturer ville være besværligt.
Ud over fysiske ændringer af platformen åbner den webbaserede software nye frihedsgrader ved at give brugerne mulighed for at skrive, redigere og dele brugertilpassede scripts og generere fuldt automatiserede, feedback aktiverede kulturprogrammer (f. eks. turbidostat). Brugere kan programmeringsmæssigt feje på tværs af parameter intervaller i subtile variationer på samme udvælgelses skema eller forbinde kontrol algoritmer i nye kombinationer for at angive et vilkårligt antal sofistikerede udvælgelses skemaer. Desuden kan evnen til nemt at overvåge kulturer i realtid omdanne den måde, hvorpå eksperimenter udføres. Med realtidsovervågning kan brugere 1) kontrollere, om der er overensstemmelse mellem kørsler, en kritisk funktion til bioproduktion og eksperimenter med høj gennemløb, og 2) gribe ind under forsøg, hvis det er nødvendigt, for at foretage fejlfinding af udfordrende stammer, der udviser lav vækst eller biofilm dannelse, eller diagnosticere bruger fejl (f. eks. kontaminering). Endelig, med flere datastrømme, der indsamles og fortolkes i realtid for hver enkelt kultur, genererer eVOLVER en høj tæthed af data, som kan lette maskinel indlæring tilgange til nye downstream analyse.
Ud over demonstrerede anvendelser for fitness karakterisering, bibliotek udvælgelse, og laboratorie udvikling, vi ser en række relaterede områder som moden til implementering i eVOLVER med integreret fluidics. Evolver-eksperimenter med mikrobiome-prøver kunne måle stabiliteten i lokalsamfundet i kontrollerede miljøer31,32, udforske mikrobiota-sammensætning ved hjælp af culturomics-teknikker33eller dynamisk blande arter til interrogat økologiske dynamik i kolonisering eller invasion34,35. Talrige metoder til kontinuerlig styret udvikling af biomolekyler kunne nemt implementeres på enheden samt26,36,37, i høj grad øge tilgængeligheden og gennemløb af disse systemer. Evnen til at optimere vækstbetingelser såsom mediernes sammensætning, temperatur og belastninger i en dynamisk, høj gennemløb natur kan støtte i optimering indsats for industrielle biomanufacturing applikationer9. Vi yderligere forestiller sig vertikalt integrere eVOLVER med andre analyseteknikker såsom mikroskopi og flow cytometri i en lukket loop mode, der giver et fuldt automatiseret system til vækst og analyse af cellulære kulturer på både enkelt celle og population Niveauer. Desuden, med nogle hardware modifikationer til Smart ærme såsom forsegling af skibet og kontrollere gas indhold, eVOLVER potentielt kunne tilpasses til at støtte væksten i en bredere vifte af celletyper, såsom suspension pattedyrceller. Det er også muligt at placere hele rammen i et anaerob kammer for anaerob cellekultur. Når vi ser fremad, stræber vi efter at opbygge vores softwarestruktur i en centraliseret Cloud-infrastruktur og mener, at dette vil gøre det muligt for brugerne nemt at konfigurere, analysere og dele deres data eksternt uden at behøve fysisk at være til stede i laboratoriet. Cloud-infrastrukturen fungerer som data kurator og egner sig også til omfattende metaanalyser på tværs af eksperimenter. Vi forventer, at eVOLVER og disse fremtidige fremskridt i høj grad vil udvide omfanget af mulige vækst udvælgelse eksperimenter ved at fremme automatisering og innovation i kontinuerlig kultur.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker B. Stafford for hans assistance i udformningen af systemet, og H. Khalil, A. Soltanianzadeh, A. Sun, S. pipe, og A. Cavale for at få hjælp til opførelsen af systemet. Vi anerkender elektronik design faciliteten (EDF), Engineering Product innovation Center (EPIC) og software & Application Innovation Lab (SAIL) på Hariri Institute for computing på Boston University for deres tjenester. Dette arbejde blev støttet af en NSF CAREER Award (MCB-1350949 til A.S.K.), og DARPA bevilger HR0011-15-C-0091 og HR0011-18-2-0014 (til A.S.K.). A.S.K. også anerkender finansiering fra NIH instruktørens nye innovator Award (1DP2AI131083-01), DARPA unge Fakultet Award (D16AP00142), og NSF ekspeditioner i computing (CCF-1522074).
5 Gallon Plastic Hedpack with cap | Midwest Brewing and Winemaking Supplies | 45-56Y8-E2FR | For waste collection |
a-D(+)-Glucose | Chem-Impex | 00805 | For YPD Medium |
Attune NxT Autosampler | Thermo Fisher | Allows Flow Cytometer to run samples from 96 well plate | |
Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher | Used to determine population fractions via single cell fluoresence | |
Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-0 | For YPD Medium |
Carbenicillin | Fisher Scientific | BP2648250 | For YPD Medium |
Chemical-Resistant Barbed Tube Fitting Tee Connector, for 1/8" Tube ID, 250°F Maximum Temperature | McMaster- Carr | 5121K731 | For media input branching |
Chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | For YPD Medium |
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25 | Fisher Scientific | 50371500 | For Sterilization of fluidic lines |
Custom eVOLVER vial lid | FynchBio | Lid has ports for sampling and fluidic input/output | |
Cycloheximide | Fisher Scientific | ICN10018301 | For flow cytometry sampling plates |
Ethanol, Anhydrous (Histological) | Fisher Scientific | A405P-4 | For sterilization of fluidic lines |
eVOLVER Unit | FynchBio | ||
Fisherbrand Extended-Length Tips (Lift Off Rack; 1 to 200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-420 | For vial sampling |
Fisherbrand Octagon Spinbar Magnetic Stirring Bars | Fisher Scientific | 14-513-57 | Diameter: 4.5 mm, Length, 12 mm |
Fisherbrand Reusable Glass Media Bottles with Cap | Fisher Scientific | FB8002000 | Must be fitted with tubing |
High-Temperature Silicone Rubber Tubing Semi-Clear White, Durometer 70A, 1/8" ID, 1/4" OD | McMaster- Carr | 51135K73 | For media bottles |
Mac Mini | Apple | For running the experiment/collecting data | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP243820 | For flow cytometry sampling plates |
Pipettes | Eppendorf | ||
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K141 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Plugs, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K144 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 1/16" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K291 | For media bottles |
Plastic Quick-Turn Tube Coupling, Sockets, for 5/32" Barbed Tube ID, Polypropylene | McMaster- Carr | 51525K294 | For media bottles |
SCREW CAPS, OPEN TOP, WITH PTFE FACED SILICONE SEPTA, LAB-PAC, SEPTUM. Screw thread size: 24-400, GREEN | Chemglass | CG-4910-04 | Culture vials |
Sodium Chloride (NaCl) | Fsher Scientific | S271-3 | For YPD Medium |
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | For measuring OD600 of overnight cell cultures | |
Vial Only, Sample, 40mL, Clear, 28x95mm, GPI 24-400 | Chemglass | CG-4902-08 | Culture vials |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | For YPD Medium |