Почечная субкапсулярная трансплантация 2'-Деоксигуанозин-обработанный Мурин Эмбриональный Тимус в обнаженных мышей
Summary
Мы предоставляем простой и эффективный метод для трансплантации 2′-деоксигуанозин лечение E18.5 тимуса в почечной капсуле обнаженной мыши. Этот метод должен помощник в изучении как тимоэпилитических клеток функции и Т-клеток созревания.
Abstract
Тимус является важным центральным иммунным органом, который играет важную роль в развитии и дифференциации Т-клеток. Трансплантация тимуса является важным методом для исследования функции тимических эпителиальных клеток и созревания Т-клеток in vivo. Здесь мы опишите экспериментальные методы, используемые в нашей лаборатории для трансплантации 2′-деоксигуанозин (для истощения лимфоцитов донора) лечение эмбрионального тимуса в почечную капсулу атимичной обнаженной мыши. Этот метод является простым и эффективным и не требует специальных навыков или устройств. Результаты, полученные с помощью этого простого метода показали, что пересаженный тимус может эффективно поддерживать производство Т-клеток реципиента. Кроме того, будут дополнительно прояснены некоторые ключевые моменты, касающиеся протокола.
Introduction
Тимус является центральным иммунным органом, в тимоцитах тимуса проходят положительныйи отрицательный отбор, и становятся зрелыми Т-клетками 1,2. Аномальный положительный или отрицательный отбор приводит киммунодефициту или аутоиммунным патологиям соответственно 3,4. Поэтому трансплантация органов тимуса является важным подходом к изучению процесса отбора Т-клеток в тимусе донора. Этот метод особенно важен при анализе тимической эпителиальной функции, опосредоченной геннымимутациями, которые вызывают эмбриональный смертельный фенотип при мутации 5.
Для изучения созревания Т-клеток реципиента в пересаженном тимусе необходимо истощение лимфоцитов донора в тимфоцитах. Для этой цели, эмбриональный 14-, 15- или 16-дневный (E14, E15,E16) тимуса обычно выбирается 6,7. Тимус из более зрелых стадий также может быть успешно истощены лимфоцитов донора путем лечения 2′-деоксигуанозина. Однако подробный протокол для истощения лимфоцитов и использования более старойкультуры тимуса ранее не был описан 8,9. В то время как протоколы трансплантации были введены несколькими исследованиями10,11, дальнейшее изменение и совершенствование этих протоколов необходимо.
Наш протокол разделен на две части: i) истощение Т-лимфоцитов от поздней стадии развития E18.5 thymus культурой в 2′-деоксигуанозин-содержащих средств массовой информации. ii) трансплантация культивированных тимуса получателям. В этой процедуре мы разработали простой способ доставки большой ткани (E18.5 thymus) в почечную капсулу с пониженной вероятностью травмы почек. Сосредоточившись на поздней стадии тимуса, наш протокол также может быть использован непосредственно или с модификациями для трансплантации тимуса на различных стадиях развития или других аналогичных размеров тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Почечная субкапсулулярная трансплантация эмбрионального тимуса является важным методом изучения функции тимических эпителиальных клеток и процесса созревания Т-клеток в vivo. Хотя Есть несколько экспериментальных исследований по эмбриональной культуры органов тимуса и трансплантац…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стартовым пакетом Университета Цзинаня в S.J. и Научно-технической программой Гуанчжоу Китая (Грант No 2017040209 в S.J.). Мы благодарим Эми Ботту (Департамент биологии, йоркский университет, Торонто, ON M3J 1P3, Канада) за коррективы и редактирование рукописи.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Referências
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
