JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Целью данного протокола является описание дизайна и выполнения экспериментов in vivo в Drosophila melanogaster для оценки функциональных последствий редких вариантов генов, связанных с болезнями человека.

Abstract

Достижения в области технологии секвенирования сделали наборы данных всего генома и цельно-экзома более доступными как для клинической диагностики, так и для передовых исследований генетики человека. Хотя ряд алгоритмов силико были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов, определенных в этих наборах данных, функциональные исследования имеют решающее значение для определения того, как конкретные геномные варианты влияют на функцию белка, особенно для неправильного Варианты. В Сети недиагностированных болезней (UDN) и других редких консорциумов исследований заболеваний, модель организмов (MO), включая Drosophila, C. elegans,зебрафиш, и мышей активно используются для оценки функции индикативного заболевания человека, вызывающих Варианты. Этот протокол описывает метод функциональной оценки редких человеческих вариантов, используемых в Центре скрининга модельных организмов Drosophila Core UDN. Рабочий процесс начинается со сбора информации о человеке и МО из нескольких общедоступных баз данных, используя веб-ресурс MARRVEL для оценки того, может ли этот вариант способствовать состоянию пациента, а также разрабатывать эффективные эксперименты на основе имеющихся знаний и ресурсов. Далее, генетические инструменты (например, T2A-GAL4 и UAS-человеческий cDNA линии) создаются для оценки функций вариантов интереса к Drosophila. После разработки этих реагентов для оценки функции вариантов могут проводиться двусторонние функциональные анализы, основанные на спасательных и переэкспрессивных экспериментах. В спасательной ветви эндогенные гены мухи «очеловечены», заменяя ортолотеозный ген дрозофилы эталонным или вариантом человеческих трансгенов. В ветви переэкспрессии, справочные и варианты человеческих белков экзогенно приводится в различных тканях. В обоих случаях любой фенотип (например, летальность, морфология глаз, электрофизиология) может использоваться в качестве считывания, независимо от заболевания, представляющих интерес. Различия, наблюдаемые между эталонными и вариантными аллелями, указывают на разновидно-специфический эффект и, таким образом, вероятную патогенность. Этот протокол позволяет быстро, in vivo оценки putative человека болезнетворных вариантов генов с известными и неизвестными функциями.

Introduction

Пациенты с редкими заболеваниями часто проходят трудное путешествие называют “диагностическая одиссея”, чтобы получить точный диагноз1. Большинство редких заболеваний, как полагают, имеют сильное генетическое происхождение, что делает генетический / геномный анализ критических элементов клинической работы. В дополнение к последовательности генной панели кандидата и анализа вариаций числа копий на основе хромосомных микроаррей, технологий секвенирования всего генома (WES) и секвенирования всего генома (WGS) стали все более ценными инструментами за последнее десятилетие2, 3. В настоящее время, диагностическая ставка для выявления известных патогенных вариантов в WES и WGS составляет 25% (выше в детских случаях)4,5. В большинстве случаев, которые остаются невыявленными после клинической WES/WGS, общая проблема заключается в том, что существует много генов и вариантов кандидатов. Секвенирование следующего поколения часто определяет новые или ультра-редкие варианты во многих генах, и интерпретация того, способствуют ли эти варианты фенотипам болезни, является сложной задачей. Например, хотя большинство ерунда или frameshift мутации в генах, как полагают, потеря функции (LOF) аллели из-за ерунды опосредованного распада закодированного транскрипта, усечение мутаций, найденных в последних экзонов избежать этого процесса и может функционировать как доброкачественные или прироста функций (GOF) аллели6.

Кроме того, прогнозирование последствий аллеля неправильного зрения является сложной задачей, так как это может привести к ряду различных генетических сценариев, как впервые описано Германом Мюллером в 1930-х (т.е. аморф, гипоморф, гиперморф, антиморф, неоморф, или изоморф)7 . Многочисленные программы силико и методологии были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов неправильности, основанных на эволюционной сохранении, типами изменения аминокислот, положением в функциональной области, частотой аллелей в общей популяции, и другие параметры8. Однако эти программы не являются комплексным решением для решения сложной проблемы интерпретации вариантов. Интересно, что недавнее исследование показало, что пять широко используемых алгоритмов прогнозирования патогенности (Полифен9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Мутация Taster) согласны на патогенность 80% времени8 . Примечательно, что даже когда все алгоритмы согласны, они возвращают неправильное предсказание патогенности до 11% времени. Это не только приводит к недостаткам клинической интерпретации, но и может отговорить исследователей от последующих на новые варианты, ложно перечисляя их как доброкачественные. Один из способов дополнить нынешнее ограничение в силико моделирования является предоставление экспериментальных данных, которые демонстрируют эффект функции варианта in vitro, ex vivo (например, культивированные клетки, органоиды), или in vivo.

In vivo функциональные исследования редких вариантов заболеваний, связанных в MO имеют уникальные сильные13 и были приняты многими редкими инициативами исследования заболеваний по всему миру, в том числе Недиагностированные болезни сети (UDN) в Соединенных Штатах и редких Болезни Модели и механизмы (RDMM) Сети в Канаде, Японии, Европе и Австралии14. В дополнение к этим скоординированным усилиям по интеграции исследователей МО в рабочий процесс диагностики редких заболеваний и механистических исследований в национальном масштабе, ряд индивидуальных совместных исследований между клиническими и MO исследователей привели к открытию и характеристика многих новых генов и вариантов, вызывающих болезни человека,82,83,84.

В UDN, централизованный модельНые органы скрининговый центр (MOSC) получает представления генов-кандидатов и вариантов с описанием состояния пациента и оценивает, является ли вариант может быть патогенным с помощью инструментов информатики и in vivo Эксперименты. В фазе I (2015-2018) UDN, MOSC состоит из Drosophila Core (Бейлор колледж медицины (BCM) и Зебрафиш ядро (Университет штата Орегон), которые работали совместно для оценки случаев. Используя анализ информатики и ряд различных экспериментальных стратегий в Drosophila и зебрафиш, MOSC до сих пор способствовали диагностике 132 пациентов, выявление 31 новых синдромов55, открытие нескольких новых человеческих гены заболеваний (например, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) и фенотипическое расширение известного заболевания гены (например, CACNA1A21,ACOX122).

В дополнение к проектам в рамках UDN, исследователи MOSC Drosophila Core внесли свой вклад в новые открытия генов болезни в сотрудничестве с Центрами менделианской геномики и другими инициативами (например, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) с использованием того же набора информатики и генетики стратегии, разработанные для UDN. Учитывая значение исследований МО по диагностике редких заболеваний, MOSC был расширен, чтобы включить ядро C. elegans и второе ядро зебрафиш (оба в Университете Вашингтона в Сент-Луисе) для фазы II (2018-2022) UDN.

Данная рукопись описывает протокол функционального исследования in vivo, который активно используется в UDN MOSC Drosophila Core, чтобы определить, имеют ли варианты неправильного зрения функциональные последствия для белка, интересуемого с помощью трансгенных мух, которые выражают человека Белки. Цель этого протокола состоит в том, чтобы помочь исследователям МО работать совместно с клиническими исследовательскими группами, чтобы предоставить экспериментальные доказательства того, что вариант кандидата в гене интереса имеет функциональные последствия, тем самым облегчая клиническую диагностику. Этот протокол является наиболее полезным в сценарии, в котором исследователь Drosophila подошел клинический исследователь, который имеет редкое заболевание пациента с конкретным вариантом кандидата в гене интереса.

Этот протокол может быть разбит на три элемента: (1) сбор информации для оценки вероятности варианта интереса, ответственного за фенотип пациента и осуществимость функционального исследования в Drosophila, (2) сбор существующих генетических инструментов и создания новых, и (3) выполнения функциональных исследований in vivo. Третий элемент можно также разделить на два подэлемента на основе того, как можно оценивать функцию варианта интереса (спасательный эксперимент или стратегии, основанные на перевыражении). Важно отметить, что этот протокол может быть адаптирован и оптимизирован для многих сценариев, не связанных с исследованиями редких моногенных заболеваний (например, распространенные заболевания, взаимодействие генно-экологических и фармакологических/генетических экранов для определения терапевтических целей). Способность определять функциональность и патогенность вариантов не только принесет пользу интересуемому пациенту, обеспечивая точную молекулярную диагностику, но и окажет более широкое влияние как на трансляционные, так и на фундаментальные научные исследования.

Protocol

1. Сбор информации человека и МО для оценки: Вероятность варианта интересов, ответственного за фенотипы болезней и целесообразность функциональных исследований в Дрософиле Выполните обширные поиски базы данных и литературы, чтобы определить, являются ли конкретные гены…

Representative Results

Функциональное исследование de novo Missense Variant в EBF3 связано с фенотипами нейроразвитияУ 7-летнего мужчины с фенотипами нейроразвития, включая гипотонию, атаксию, глобальную задержку развития и выразительное нарушение речи, врачей и генетиков человека в Национальном проект…

Discussion

Экспериментальные исследования с использованием Drosophila melanogaster обеспечивают надежную систему ассеев для оценки последствий связанных с болезнью человеческих вариантов. Это связано с большим объемом знаний и разнообразных генетических инструментов, которые были созданы многими ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Хосе Салазара, Джулию Ван и д-ра Карен Шульце за критическое прочтение рукописи. Мы признаем, д-р Нин Лю и Си Луо для функциональной характеристики TBX2 варианты обсуждаются здесь. Недиагностированные болезни Сети Модель Органы Скрининговый центр был поддержан через Национальные институты здравоохранения (NIH) Общий фонд (U54 NS093793). H. T. C. была дополнительно поддержана NIH-CNCDP-K12 и NINDS (1K12 NS098482) ” , Американской академией неврологии (Неврология исследований грант), Берроуз Wellcome фонд (Карьера премии для медицинских ученых), Детское общество неврологии и детской неврологии фонда ( PERF Elterman грант), и NIH директора ранней независимости премии (DP5 OD026426). М. Ф.В. получил поддержку Фонда Симонса (Премия SFARI: 368479). S. Y. была также поддержана NIH (R01 DC014932), Фондом Симонса (Премия SFARI: 368479), Ассоциацией Альцгеймера (Новый грант исследователей: 15-364099), Наманским семейным фондом фундаментальных исследований и Фондом права Кэролайн Висс в Молекулярная медицина. Конфокальная микроскопия в BCM частично поддерживается NIH Grant U54HD083092 в Центр евразийных и опытно-конструкторских исследований (IDDRC) Neurovisualization Core.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genética. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genética. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genética. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genética. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Biologia do Desenvolvimento. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors
check_url/pt/59658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image