En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila
Summary
El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.
Abstract
Los avances en la tecnología de secuenciación han hecho que los conjuntos de datos de genoma completo y de exoma completo sean más accesibles tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación en genética humana de vanguardia. Aunque se han desarrollado varios algoritmos in silico para predecir la patogenicidad de las variantes identificadas en estos conjuntos de datos, los estudios funcionales son críticos para determinar cómo las variantes genómicas específicas afectan la función proteica, especialmente por tener un sentido erróneo Variantes. En la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) y otros consorcios de investigación de enfermedades raras, organismos modelo (MO) incluyendo Drosophila, C. elegans,pez cebra y ratones se utilizan activamente para evaluar la función de la enfermedad humana putativa Variantes. Este protocolo describe un método para la evaluación funcional de variantes humanas raras utilizadas en el Centro de Detección de Organismos Modelo Drosophila Core de la UDN. El flujo de trabajo comienza con la recopilación de información humana y MO de múltiples bases de datos públicas, utilizando el recurso web MARRVEL para evaluar si la variante es probable que contribuya a la condición de un paciente, así como diseñar experimentos eficaces basados en disponibles conocimientos y recursos. A continuación, se generan herramientas genéticas (por ejemplo, líneas de ADNc humanos T2A-GAL4 y UAS) para evaluar las funciones de las variantes de interés en Drosophila. Tras el desarrollo de estos reactivos, se pueden realizar ensayos funcionales de dos puntas basados en experimentos de rescate y sobreexpresión para evaluar la función de las variantes. En la rama de rescate, los genes de la mosca endógena se “humanizan” reemplazando el gen de la Drosophila ortopéloga por transgenes humanos de referencia o variante. En la rama de sobreexpresión, las proteínas humanas de referencia y variante se impulsan exógenamente en una variedad de tejidos. En ambos casos, cualquier fenotipo escorable (por ejemplo, letalidad, morfología ocular, electrofisiología) se puede utilizar como lectura, independientemente de la enfermedad de interés. Las diferencias observadas entre los alelos de referencia y de variante sugieren un efecto específico de la variante, y por lo tanto probablemente la patogenicidad. Este protocolo permite evaluaciones rápidas e in vivo de variantes putativas causantes de enfermedades humanas de genes con funciones conocidas y desconocidas.
Introduction
Los pacientes con enfermedades raras a menudo se someten a un arduo viaje conocido como la “odisea diagnóstica” para obtener un diagnóstico preciso1. Se cree que la mayoría de las enfermedades raras tienen un fuerte origen genético, lo que hace que los análisis genéticos/genómicos sean elementos críticos del estudio clínico. Además de la secuenciación de paneles genéticos candidatos y el análisis de variación de los números de copia basados en microarrays cromosómicos, las tecnologías de secuenciación de todo el exónmio (WES) y de secuenciación del genoma completo (WGS) se han convertido en herramientas cada vez más valiosas en la última década2, 3. Actualmente, la tasa de diagnóstico para la identificación de una variante patógena conocida en WES y WGS es de 25% (mayor en casos pediátricos)4,5. Para la mayoría de los casos que permanecen sin diagnosticar después del WES/WGS clínico, un problema común es que hay muchos genes y variantes candidatas. La secuenciación de próxima generación a menudo identifica variantes novedosas o ultra raras en muchos genes, y la interpretación de si estas variantes contribuyen a los fenotipos de la enfermedad es un reto. Por ejemplo, aunque se cree que la mayoría de las mutaciones sin sentido o en marcadas en los genes son alelos de pérdida de función (LOF) debido a la descomposición mediada por tonterías de la transcripción codificada, las mutaciones truncadas encontradas en los últimos exones escapan a este proceso y pueden funcionar como alelos benignos o de ganancia de función (GOF)6.
Por otra parte, predecir los efectos de un alelo de sentido erróneo es una tarea desalentadora, ya que puede dar lugar a una serie de diferentes escenarios genéticos como se describe por primera vez por Herman Muller en la década de 1930 (es decir, amorfo, hipómorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo o isomorfo)7 . Numerosos programas y metodologías en silico se han desarrollado para predecir la patogenicidad de variantes de mala detección basadas en la conservación evolutiva, el tipo de cambio de aminoácidos, la posición dentro de un dominio funcional, la frecuencia del alelo en la población general, y otros parámetros8. Sin embargo, estos programas no son una solución integral para resolver el complicado problema de la interpretación de variantes. Curiosamente, un estudio reciente demostró que cinco algoritmos de predicción de patogenicidad variante ampliamente utilizados (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) están de acuerdo en la patogenicidad -80% del tiempo8 . En particular, incluso cuando todos los algoritmos están de acuerdo, devuelven una predicción incorrecta de patogenicidad hasta el 11% del tiempo. Esto no sólo conduce a una interpretación clínica defectuosa, sino que también puede disuadir a los investigadores de dar seguimiento a nuevas variantes al enumerarlas falsamente como benignas. Una forma de complementar la limitación actual del modelado de silico es proporcionar datos experimentales que demuestren el efecto de la función variante in vitro, ex vivo (por ejemplo, células cultivadas, organoides) o in vivo.
Los estudios funcionales in vivo de variantes asociadas a enfermedades raras en MO tienen fortalezas únicas13 y han sido adoptados por muchas iniciativas de investigación de enfermedades raras en todo el mundo, incluyendo la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) en los Estados Unidos y Rare Redes de Modelos y Mecanismos de Enfermedades (RDMM) en Canadá, Japón, Europa y Australia14. Además de estos esfuerzos coordinados para integrar a los investigadores de MO en el flujo de trabajo de diagnóstico de enfermedades raras y estudios mecánicos a escala nacional, una serie de estudios de colaboración individuales entre investigadores clínicos y de MO han llevado al descubrimiento y la caracterización de muchos nuevos genes y variantes causantes de enfermedades humanas82,83,84.
En la UDN, un Centro centralizado de Cribado de Organismos Modelo (MOSC) recibe presentaciones de genes y variantes candidatas con una descripción de la condición del paciente y evalúa si la variante es probable que sea patógena utilizando herramientas informáticas e in vivo Experimentos. En la Fase I (2015-2018) de la UDN, el MOSC comprendía un Núcleo Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] y Zebrafish Core (Universidad de Oregón) que trabajaba en colaboración para evaluar casos. Utilizando el análisis informático y una serie de estrategias experimentales diferentes en Drosophila y pez cebra, el MOSC ha contribuido hasta ahora al diagnóstico de 132 pacientes, identificación de 31 nuevos síndromes55,descubrimiento de varios nuevos genes de la enfermedad (p. ej., EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) y expansión fenotípica de la enfermedad conocida genes (por ejemplo, CACNA1A21,ACOX122).
Además de los proyectos dentro de la UDN, los investigadores del MOSC Drosophila Core han contribuido a los nuevos descubrimientos genéticos de la enfermedad en colaboración con los Centros de Genómica Mendeliana y otras iniciativas (por ejemplo, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) utilizando el mismo conjunto de informática y genética estrategias desarrolladas para la UDN. Dada la importancia de los estudios de MO sobre el diagnóstico de enfermedades raras, el MOSC se amplió para incluir un núcleo de C. elegans y un segundo núcleo de pez cebra (ambos en la Universidad de Washington en St. Louis) para la Fase II (2018-2022) de la UDN.
Este manuscrito describe un protocolo de estudio funcional in vivo que se utiliza activamente en el núcleo de Drosophila UDN MOSC para determinar si las variantes de mala detección tienen consecuencias funcionales en la proteína de interés utilizando moscas transgénicas que expresan Proteínas. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores de MO a trabajar en colaboración con grupos de investigación clínica para proporcionar evidencia experimental de que una variante candidata en un gen de interés tiene consecuencias funcionales, facilitando así el diagnóstico clínico. Este protocolo es más útil en un escenario en el que un investigador de Drosophila es abordado por un investigador clínico que tiene un paciente de enfermedad rara con una variante candidata específica en un gen de interés.
Este protocolo se puede dividir en tres elementos: (1) recopilar información para evaluar la probabilidad de que la variante de interés sea responsable del fenotipo del paciente y la viabilidad de un estudio funcional en Drosophila,(2) herramientas genéticas existentes y el establecimiento de otras nuevas, y (3) realizar estudios funcionales in vivo. El tercer elemento se puede subdividir en dos subelementos en función de cómo se puede evaluar la función de una variante de interés (experimento de rescate o estrategias basadas en sobreexpresión). Es importante tener en cuenta que este protocolo puede adaptarse y optimizarse a muchos escenarios fuera de la investigación de enfermedades monogénicas raras (por ejemplo, enfermedades comunes, interacciones gene-ambiente y pantallas farmacológicas/genéticas para identificar dianas terapéuticas). La capacidad de determinar la funcionalidad y la patogenicidad de las variantes no sólo beneficiará al paciente de interés al proporcionar un diagnóstico molecular preciso, sino que también tendrá impactos más amplios en la investigación científica tanto traslacional como básica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios experimentales con Drosophila melanogaster proporcionan un sistema de ensayo robusto para evaluar las consecuencias de las variantes humanas asociadas a la enfermedad. Esto se debe a la gran cantidad de conocimiento y diversas herramientas genéticas que han sido generadas por muchos investigadores en el campo de la mosca durante el siglopasado 89. Al igual que cualquier otro sistema experimental, sin embargo, es importante reconocer las advertencias y limitaciones que existe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a José Salazar, Julia Wang y a la Dra. Karen Schulze por la lectura crítica del manuscrito. Reconocemos a los Doctores Ning Liu y Xi Luo por la caracterización funcional de las variantes TBX2 discutidas aquí. El Centro de Detección de Organismos Modelo de la Red de Enfermedades No Diagnosticadas fue apoyado a través del Fondo Común de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. fue apoyado además por el NIH[CNCDP-K12 y NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), y el Premio de La Independencia Temprana del Director de los NIH (DP5 OD026426). M. F. W. fue apoyado por la Fundación Simons (Premio SFARI: 368479). S. Y. fue apoyado además por el NIH (R01 DC014932), la Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), la Asociación de Alzheimer (New Investigator Research Grant: 15-364099), Naman Family Fund for Basic Research, y Caroline Wiess Law Fund for Research in in Medicina Molecular. La microscopía confocal de BCM es apoyada en parte por NIH Grant U54HD083092 al Núcleo de Neurovisualización del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo (IDDRC).
Materials
| Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
| Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
| Plasmid DNA | |||
| Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
| Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
| Molecular biology kits and reagents | |||
| Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
| Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
| DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
| DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
| High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
| Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
| Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
| Electroretinogram Rig related equipment | |||
| ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
| ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
| ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |
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