Målet med denne protokollen er å skissere design og ytelse av in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster å vurdere funksjonelle konsekvenser av sjeldne gen varianter knyttet til menneskelige sykdommer.
Fremskritt i sekvensering teknologi har gjort hele-Genova og hel-exome datasett mer tilgjengelig for både klinisk diagnose og banebrytende menneskelig genetikk forskning. Selv om en rekke i silisiummangan algoritmer er utviklet for å forutsi patogenitet av variantene identifisert i disse datasettene, er funksjons studier avgjørende for å avgjøre hvordan spesifikke genomisk varianter påvirker protein funksjonen, spesielt for missense Varianter. I udiagnostisert sykdommer Network (UDN) og andre sjeldne sykdom forskning konsortier, modell organismer (MO) inkludert Drosophila, C. elegans, sebrafisk, og mus er aktivt brukes til å vurdere funksjonen av antatte menneskelig sykdom-forårsaker Varianter. Denne protokollen beskriver en metode for funksjonell vurdering av sjeldne menneskelige varianter som brukes i modellen organismer screening Center Drosophila kjernen i UDN. Arbeidsflyten begynner med å samle menneskelig og MO informasjon fra flere offentlige databaser, ved hjelp av MARRVEL webressurs for å vurdere om varianten er sannsynlig å bidra til pasientens tilstand, samt design effektive eksperimenter basert på tilgjengelige kunnskap og ressurser. Neste, genetiske verktøy (f. eks, T2A-GAL4 og UAS-Human cDNA linjer) er generert for å vurdere funksjonene til varianter av interesse i Drosophila. Ved utvikling av disse reagensene, kan to-kanter funksjonelle analyser basert på redning og overuttrykte eksperimenter utføres for å vurdere variant funksjon. I rednings grenen, den endogene fly gener er “humanisert” ved å erstatte orthologous Drosophila genet med referanse eller variant menneskelig transgenes. I overuttrykte grenen er referanse og variant humane proteiner exogenously drevet i en rekke vev. I begge tilfeller kan enhver scorable fenotype (f. eks, dødelighet, øye morfologi, elektrofysiologi) brukes som en lese-ut, uavhengig av sykdom av interesse. Forskjeller observert mellom referanse og variant alleler foreslå en variant-spesifikk effekt, og dermed sannsynlig patogenitet. Denne protokollen tillater raske, in vivo vurderinger av antatte menneskelige sykdom-forårsaker varianter av gener med kjente og ukjente funksjoner.
Pasienter med sjeldne sykdommer ofte gjennomgår en krevende reise referert til som “diagnostiske Odyssey” for å få en nøyaktig diagnose1. De fleste sjeldne sykdommer antas å ha en sterk genetisk opprinnelse, noe som gjør genetisk/genomisk analyser kritiske elementer av klinisk workup. I tillegg til kandidat gen panel sekvensering og kopiere nummer variasjon analyse basert på kromosom Microarrays, hel-exome (WES) og hele-Genova sekvensering (WGS) teknologier har blitt stadig mer verdifulle verktøy i løpet av det siste tiåret2, 3i denne. For tiden er diagnostisk rate for å identifisere en kjent sykdomsfremkallende variant i Wes og WGS er ~ 25% (høyere i pediatric tilfeller)4,5. For de fleste tilfeller som forblir udiagnostisert etter klinisk WES/WGS, er et vanlig problem at det er mange kandidat gener og varianter. Neste generasjons sekvensering identifiserer ofte romanen eller Ultra-sjeldne varianter i mange gener, og tolke om disse variantene bidra til sykdom fenotyper er utfordrende. For eksempel, selv om de fleste tull eller frameshift mutasjoner i gener antas å være tap-of-Function (LOF) alleler på grunn av tull-mediert forfall av kodet transkripsjon, å avkorte mutasjoner funnet i den siste exoner unnslippe denne prosessen og kan fungere som godartet eller gevinst-av-funksjon (GOF) alleler6.
Videre er det å forutsi virkningene av en missense allel en skremmende oppgave, siden det kan resultere i en rekke forskjellige genetiske scenarioer som først beskrevet av Herman Muller på 1930-tallet (dvs. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph eller isomorph)7 . Tallrike i silisiummangan programmer og metoder er utviklet for å forutsi patogenitet av missense varianter basert på evolusjonære bevaring, type aminosyre endring, posisjon innenfor et funksjonelt domene, allel frekvens i den generelle befolkningen, og andre parametre8. Men disse programmene er ikke en omfattende løsning for å løse det kompliserte problemet med variant tolkning. Interessant, en fersk studie viste at fem bredt brukt variant patogenitet prediksjon algoritmer (Polyphen9, sile10, CADD11, PROVEAN12, mutasjon forsmak) enige om patogenitet ~ 80% av tiden8 . Spesielt, selv når alle algoritmer er enige, returnerer de en feil prediksjon av patogenitet opp til 11% av tiden. Dette ikke bare fører til feil klinisk tolkning, men også kan fraråde forskere fra å følge opp nye varianter av feilaktig liste dem som godartet. En måte å utfylle den nåværende begrensningen av i silisiummangan modellering er å gi eksperimentelle data som demonstrerer effekten av varianten funksjon in vitro, ex vivo (f. eks, kulturperler celler, organoids), eller in vivo.
I vivo funksjonelle studier av sjelden sykdom assosierte varianter i MO har unike styrke13 og har blitt vedtatt av mange sjeldne sykdoms forskning initiativer rundt om i verden, inkludert udiagnostisert sykdommer Network (UDN) i USA og sjeldne Sykdommer modeller & mekanismer (RDMM) nettverk i Canada, Japan, Europa og Australia14. I tillegg til disse koordinerte tiltakene for å integrere MO-forskere i arbeidsflyten av sjeldne sykdoms diagnoser og mekanistisk studier i nasjonal målestokk, har en rekke individuelle samarbeids studier mellom kliniske og MO-forskere ført til oppdagelsen og karakterisering av mange nye menneskelig sykdom-forårsaker gener og varianter82,83,84.
I UDN, en sentralisert modell organismer screening Center (MOSC) mottar innleveringer av kandidat gener og varianter med en beskrivelse av pasientens tilstand og vurderer om varianten er sannsynlig å være patogene ved hjelp av informatikk verktøy og in vivo Eksperimenter. I fase i (2015-2018) av UDN, MOSC består av en Drosophila Core [Baylor College of MEDICINE (bcm)] og sebrafisk Core (University of Oregon) som jobbet sammen for å vurdere tilfeller. Ved hjelp av informatikk analyse og en rekke ulike eksperimentelle strategier i Drosophila og sebrafisk, har MOSC så langt bidratt til diagnostisering av 132 pasienter, identifisering av 31 nye syndromer55, oppdagelsen av flere nye menneskelige sykdoms gener (f. eks EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) og fenotypiske utvidelse av kjent sykdom gener (f.eks. CACNA1A21, ACOX122).
I tillegg til prosjekter innenfor UDN, har MOSC Drosophila kjerne forskere bidratt til nye sykdoms gen funn i samarbeid med Centers for mendelsk Genomics og andre initiativer (f. eks ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) med samme sett av informatikk og genetisk strategier utviklet for UDN. Gitt betydningen av MO studier på sjelden sykdom diagnose, MOSC ble utvidet til å omfatte en C. elegans Core og andre sebrafisk kjerne (begge ved Washington University i St. Louis) for fase II (2018-2022) av UDN.
Dette manuskriptet beskriver en in vivo funksjonell studie protokoll som brukes aktivt i UDN MOSC Drosophila Core for å avgjøre om missense varianter har funksjonelle konsekvenser for protein av interesse ved hjelp av transgene fluer som uttrykker menneskelig Proteiner. Målet med denne protokollen er å hjelpe MO forskere samarbeider med kliniske forskningsgrupper for å gi eksperimentelle bevis på at en kandidat variant i et gen av interesse har funksjonelle konsekvenser, og dermed tilrettelegge klinisk diagnose. Denne protokollen er mest nyttig i et scenario der en Drosophila forsker er nærmet av en klinisk etterforsker som har en sjelden sykdom pasient med en bestemt kandidat variant i et gen av interesse.
Denne protokollen kan brytes ned i tre elementer: (1) samle informasjon for å vurdere sannsynligheten for den varianten av interesse å være ansvarlig for pasienten fenotype og muligheten for en funksjonell studie i Drosophila, (2) samle eksisterende genetiske verktøy og etablere nye, og (3) utfører funksjonelle studier in vivo. Det tredje elementet kan videre deles inn i to underelementer basert på hvordan funksjonen til en variant av interesse kan vurderes (redning eksperiment eller overuttrykte strategier). Det er viktig å merke seg at denne protokollen kan tilpasses og optimaliseres til mange scenarier utenfor sjeldne monogenic sykdom forskning (for eksempel vanlige sykdommer, gen-miljø interaksjoner, og farmakologiske/genetiske skjermer for å identifisere terapeutiske mål). Evnen til å bestemme funksjonaliteten og patogenitet av variantene vil ikke bare gagne pasienten av interesse ved å gi nøyaktig molekylær diagnose, men vil også ha bredere virkninger på både translational og grunnleggende vitenskapelig forskning.
Eksperimentelle studier med Drosophila melanogaster gir en robust analysen system for å vurdere konsekvensene av sykdom-assosiert menneskelige varianter. Dette er på grunn av den store kroppen av kunnskap og diverse genetiske verktøy som har blitt generert av mange forskere i fly feltet over det siste århundret89. Akkurat som alle andre eksperimentelle system, men det er viktig å erkjenne de begrensninger og begrensninger som finnes.
Advarsler knyt…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jose Salazar, Julia Wang, og Dr. Karen Schulze for kritisk lesning av manuskriptet. Vi erkjenner DRS. ning Liu og XI Luo for funksjonell karakterisering av TBX2 varianter diskutert her. Udiagnostisert sykdommer nettverk modell organismer screening Center ble støttet gjennom National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. ble videre støttet av NIH [CNCDP-k12 og NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of nevrologi (nevrovitenskap Research Grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for medisinske forskere), Child Nevrologi Society og Child Nevrologi Foundation ( Elterman stipend), og NIH Director ‘ s Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. ble ytterligere støttet av Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. ble videre støttet av NIH (R01 DC014932), Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer ‘ s Association (ny etterforsker Research Grant: 15-364099), naman Family Fund for Basic Research, og Caroline Wiess Law Fund for Research i Molekylær medisin. Konfokalmikroskopi mikroskopi på BCM støttes delvis av NIH Grant U54HD083092 til Intellectual og utviklingsmessige funksjonshemminger Research Center (IDDRC) Neurovisualization Core.
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
Plasmid DNA | |||
Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
Molecular biology kits and reagents | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
Electroretinogram Rig related equipment | |||
ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |