Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Summary

O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Abstract

Os avanços na tecnologia de sequenciamento tornaram os conjuntos de dados de todo o genoma e todo-exome mais acessíveis tanto para o diagnóstico clínico quanto para a pesquisa genética humana de ponta. Embora vários algoritmos de silico tenham sido desenvolvidos para prever a patogenicidade das variantes identificadas nesses conjuntos de dados, os estudos funcionais são fundamentais para determinar como as variantes genômica específicas afetam a função protéica, especialmente para o missense Variantes. Na rede de doenças não diagnosticadas (UDN) e outros consórcios de pesquisa de doenças raras, os organismos modelo (MO), incluindo a Drosophila, C. elegans, zebrafish e camundongos, são usados ativamente para avaliar a função da doença putativa humana-causando Variantes. Este protocolo descreve um método para a avaliação funcional de variações humanas raras usadas no núcleo da Drosophila do centro de seleção dos organismos modelo do UDN. O fluxo de trabalho começa com a coleta de informações humanas e de MO de vários bancos de dados públicos, usando o recurso da Web MARRVEL para avaliar se a variante é susceptível de contribuir para a condição de um paciente, bem como projetar experimentos eficazes com base em disponíveis conhecimento e recursos. Em seguida, são geradas ferramentas genéticas (por exemplo, linhas T2A-GAL4 e UAS-Human cDNA) para avaliar as funções de variantes de interesse na Drosophila. Em cima do desenvolvimento destes reagentes, os ensaios funcionais Two-pronged baseados em experimentos do salvamento e da superexpressão podem ser executados para avaliar a função variante. No ramo de resgate, os genes de mosca endógena são "humanizados" substituindo o gene da Drosophila ortologosa por transgenes humanos de referência ou variante. No ramo de superexpressão, as proteínas humanas de referência e variante são conduzidas exogenamente em uma variedade de tecidos. Em ambos os casos, todo o phenotype pontuáveis (por exemplo, letalidade, morfologia do olho, electrophysiology) pode ser usado como uma leitura-para fora, independentemente da doença do interesse. As diferenças observadas entre os alelos de referência e variantes sugerem um efeito variante-específico e, portanto, provável patogenicidade. Este protocolo permite avaliações rápidas, in vivo, de variantes de genes causadores de doenças humanas putativas com funções conhecidas e desconhecidas.

Introduction

Pacientes com doenças raras muitas vezes passam por uma árdua jornada referida como a "Odisseia diagnóstica" para obter um diagnóstico preciso¹. A maioria de doenças raras são pensados para ter uma origem genética forte, fazendo análises genéticas/genomic elementos críticos do workup clínico. Além do que o seqüenciamento do painel do gene do candidato e a análise da variação do número da cópia baseadas em Microarrays cromossomáticos, as tecnologias Whole-exome (WES) e do inteiro-genoma que sequenciam (WGS) tornaram-se ferramentas cada vez mais valiosas sobre a década passada^2, a ³. Atua....

Protocol

1. coleta de informações humanas e MO para avaliar: probabilidade de uma variante de interesse ser responsável por fenótipos de doenças e viabilidade de estudos funcionais em Drosophila

1. Realize pesquisas extensas de banco de dados e literatura para determinar se os genes e variantes de interesse específicos são bons candidatos para explicar o fenótipo do paciente de interesse. Especificamente, reúna as seguintes informações.
   1. Avalie se o gene do interesse estêve implicado previamente em outras desordens genéticas (expansão fenotípica do gene conhecido da doença) ou este é um gene inteiramente novo do candidato da doença [va....

Results

Estudo funcional de de novo variante missense em EBF3 ligado a fenótipos de neurodesenvolvimento
Em um macho dos anos de idade 7 com os fenótipos do neurodesenvolvimento que incluem a hipotonia, a ataxia, o atraso desenvolvente global, e a desordem de discurso expressivo, os médicos e os geneticistas humanos nos institutos nacionais da saúde projeto das doenças undiagnosed (UDP) identificou uma variante de missense de novo (p. R163Q) em EBF3 (Early b-Cell factor 3)

Discussion

Estudos experimentais utilizando Drosophila melanogaster proporcionam um sistema de ensaio robusto para avaliar as consequências das variantes humanas associadas à doença. Isto é devido ao grande corpo do conhecimento e das ferramentas genéticas diversas que foram geradas por muitos investigadores no campo da mosca sobre o século passado⁸⁹. Assim como qualquer outro sistema experimental, no entanto, é importante reconhecer as advertências e limitações que existem.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Estoques para transgênese de cDNA humano UAS
Cepas de injeção para transgênese (D. melanogaster)	BDSC	#24871	Reagente específico: VK33 (3º cromossomo) Linha de injeção
Cepas de injeção para transgênese (D. melanogaster)	BDSC	#24872	Reagente específico: VK37 (2º cromossomo) Linha de injeção
DNA plasmidial
Vetor de clonagem	Thermo Fisher	#12536-017	Reagente específico: pDONR221
Drosophila vetor de transgênese	Presente dos Drs. Johannes Bischof e Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)		Reagente específico: pGW-HA.attB
Kits e reagentes de biologia molecular
Agarose	Sigma-Aldrich	#A2790	Reagente específico: Agarose (grau de biologia molecular)
Células quimicamente competentes (E. coli)	Thermo Fisher	#18265017	Reagente específico: DH5&alfa;
Kit de extração de gel de DNA	Thermo Fisher	#K210012	Reagente específico: Kit de extração de gel PureLink
Kit de isolamento e purificação de DNA	Qiagen	#27104	Reagente específico: Kit de minipreparação de spin QIAprep
Polimerase de alta fidelidade	NEB	#M0491	Reagente específico: Kit de polimerase Q5
Sistema de clonagem mediado por recombinase	Thermo Fisher	#11789020	Reagente específico: Kit de clonase Gateway BP
de clonagem mediado por recombinase	Thermo Fisher	#11791100	Reagente específico: Kit enzimático Gateway LR Clonase II
Kit de mutagênese dirigida ao local	Agilent	#200523	Reagente específico: Kit de mutagênese Quick Change
IIEquipamento relacionado ao equipamento de eletrorretinograma
ERG Analysis	Molecular Devices	/A	Reagente Específico: Axon pCLAMP 10 Pacote de Software de Dados
ERG Coleta de Dados	LabX	#R150358	Reagente Específico: Amplificador Biológico Isolado ISO-DAM
Estimulador ERG	Astro-Med	#S48	Reagente Específico: Estimulador de Pulso Quadrado