Formålet med denne protokol er at skitsere design og udførelse af in vivo eksperimenter i Drosophila melanogaster for at vurdere de funktionelle konsekvenser af sjældne genvarianter forbundet med sygdomme hos mennesker.
Fremskridt i sekvensering teknologi har gjort helgenom og hel-exome datasæt mere tilgængelige for både klinisk diagnose og banebrydende humangenetik forskning. Selv om der er udviklet en række in silico-algoritmer til at forudsige patogeniciteten af varianter, der er identificeret i disse datasæt, er funktionelle undersøgelser afgørende for at bestemme, hvordan specifikke genomvarianter påvirker protein funktionen, især for missense Varianter. I netværket af udiagnosticerede sygdomme (UDN) og andre forskningskonsortier for sjældne sygdomme, anvendes modelorganismer (MO), herunder Drosophila, C. elegans, zebrafish og mus, til at vurdere funktionen af formodede humane sygdomsfremkaldende Varianter. Denne protokol beskriver en metode til funktionel vurdering af sjældne humane varianter, der anvendes i modellen organismer screening Center Drosophila kernen af udn. Arbejdsprocessen begynder med indsamling af menneskelige og MO-oplysninger fra flere offentlige databaser ved hjælp af MARRVEL-webressourcen for at vurdere, om varianten sandsynligvis vil bidrage til en patients tilstand, samt udforme effektive eksperimenter baseret på tilgængelige viden og ressourcer. Dernæst genereres genetiske værktøjer (f. eks. T2A-GAL4 og UAS-humane cDNA-linjer) for at vurdere funktionerne af varianter af interesse i Drosophila. Ved udvikling af disse reagenser, to-strenget funktionelle assays baseret på redning og overekspression eksperimenter kan udføres for at vurdere variant funktion. I rednings grenen er de endogene flue gener “humaniseret” ved at erstatte det ortoloøse Drosophila -gen med reference eller variant humane transgener. I overekspression gren, er reference og variant humane proteiner eksogent drevet i en række forskellige væv. I begge tilfælde kan enhver brændende fænotype (f. eks. dødelighed, øjen morfologi, Elektrofysiologi) anvendes som en udlæsning, uanset hvilken sygdom der er af interesse. Forskelle observeret mellem reference og variant alleler tyder på en variant-specifik effekt, og dermed sandsynligvis patogenicitet. Denne protokol giver mulighed for hurtige, in vivo vurderinger af formodede menneskelige sygdomsfremkaldende varianter af gener med kendte og ukendte funktioner.
Patienter med sjældne sygdomme gennemgår ofte en besværlig rejse benævnt “diagnostisk Odyssey” for at opnå en nøjagtig diagnose1. De fleste sjældne sygdomme menes at have en stærk genetisk oprindelse, hvilket gør genetisk/genomisk analyse af kritiske elementer i det kliniske arbejdsforhold. Ud over kandidat genpanel sekvensering og kopi nummer variation analyse baseret på kromosomale mikroarrays, hele exome (Wes) og hel-Genome sekventering (WGS) teknologier er blevet stadig mere værdifulde værktøjer i løbet af de sidste årti2, 3. I øjeblikket, den diagnostiske sats for at identificere en kendt patogene variant i Wes og WGS er ~ 25% (højere i pædiatriske tilfælde)4,5. For de fleste tilfælde, der forbliver udiagnosticeret efter kliniske WES/WGS, et almindeligt problem er, at der er mange kandidat gener og varianter. Næste generations sekvensering identificerer ofte nye eller ultra-sjældne varianter i mange gener og fortolker, om disse varianter bidrager til sygdoms fænotyper, er udfordrende. For eksempel, selv om de fleste nonsens eller frameshift mutationer i gener menes at være tab-of-funktion (LOF) alleler på grund af nonsens-medieret henfald af den kodede afskrift, afkortning mutationer fundet i de sidste exons undslippe denne proces og kan fungere som godartet eller forstærknings funktion (GOF) alleler6.
Desuden, forudsige virkningerne af en missense allel er en skræmmende opgave, da det kan resultere i en række forskellige genetiske scenarier som første beskrevet af Herman Muller i 1930 ‘ erne (dvs., Amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, eller isomorph)7 . Talrige i silico programmer og metoder er blevet udviklet til at forudsige patogenicitet af missense varianter baseret på evolutionære bevaring, type af aminosyre ændring, position inden for et funktionelt domæne, allel hyppighed i den almindelige befolkning, og andre parametre8. Men disse programmer er ikke en omfattende løsning til at løse det komplicerede problem med variant fortolkning. Interessant, en nylig undersøgelse viste, at fem bredt anvendte varianten patogenicitet forudsigelse algoritmer (Polyphen9, SIFT10, cadd11, Provean12, mutation smagsprøve) enige om patogenicitet ~ 80% af tiden8 . Især, selv når alle algoritmer er enige, de returnerer en ukorrekt forudsigelse af patogenicitet op til 11% af tiden. Dette fører ikke kun til fejlagtig klinisk fortolkning, men kan også afskrække forskere fra at følge op på nye varianter ved fejlagtigt at opføre dem som godartede. En måde at supplere den nuværende begrænsning af i silico modellering er at tilvejebringe eksperimentelle data, der viser effekten af variant funktionen in vitro, ex vivo (f. eks. dyrkede celler, organoider) eller in vivo.
In vivo funktionelle undersøgelser af sjældne sygdomme associerede varianter i MO har unikke styrker13 og er blevet vedtaget af mange sjældne sygdoms forskning initiativer rundt om i verden, herunder de udiagnosticerede sygdomme netværk (udn) i USA og sjældne Sygdomme modeller & mekanismer (RDMM) netværk i Canada, Japan, Europa og Australien14. Ud over disse koordinerede bestræbelser på at integrere MO-forskere i arbejdsgangen for diagnosticering af sjældne sygdomme og Mekanistiske undersøgelser på nationalt plan har en række individuelle samarbejds undersøgelser mellem kliniske og MO-forskere ført til opdagelsen og karakterisering af mange nye menneskelige sygdomsfremkaldende gener og varianter82,83,84.
I UDN modtager en centraliseret model organismer screening Center (MOSC) indsendelse af kandidat gener og varianter med en beskrivelse af patientens tilstand og vurderer, om varianten sandsynligvis vil være sygdomsfremkaldende ved hjælp af edb-værktøjer og in vivo Eksperimenter. I fase i (2015-2018) af UDN bestod MOSC af en Drosophila Core [Baylor College of MEDICINE (bcm)] og Zebrafish Core (University of Oregon), der arbejdede sammen om at vurdere sagerne. Ved hjælp af informatik analyse og en række forskellige eksperimentelle strategier i Drosophila og zebrafish, har mosc hidtil bidraget til diagnosticering af 132 patienter, identifikation af 31 nye syndromer55, opdagelse af flere nye menneskelige sygdomsgener (f. eks. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) og fænotypiske ekspansion af kendt sygdom gener (f. eks. CACNA1A21, ACOX122).
Ud over projekter inden for UDN har MOSC Drosophila kerne forskere bidraget til nye sygdoms genopdagelser i samarbejde med centrene for Mendelian Genomics og andre initiativer (f. eks. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) ved hjælp af samme sæt af informatik og genetiske strategier udviklet til UDN. I betragtning af betydningen af MO undersøgelser om sjældne sygdomme diagnose, MOSC blev udvidet til at omfatte en C. elegans kerne og anden Zebrafish kerne (både på Washington University ved St. Louis) for fase II (2018-2022) af udn.
Dette manuskript beskriver en in vivo funktionel studie protokol, der bruges aktivt i UDN MOSC Drosophila kerne til at afgøre, om missense varianter har funktionelle konsekvenser på det protein af interesse ved hjælp af transgene fluer, der udtrykker menneskelig Proteiner. Målet med denne protokol er at hjælpe MO forskere med at arbejde sammen med kliniske forskningsgrupper for at tilvejebringe eksperimentelle beviser for, at en kandidat variant i et gen af interesse har funktionelle konsekvenser, hvilket letter den kliniske diagnose. Denne protokol er mest nyttig i et scenarie, hvor en Drosophila forsker kontaktes af en klinisk investigator, der har en sjælden sygdom patient med en specifik kandidat variant i et gen af interesse.
Denne protokol kan opdeles i tre elementer: (1) indsamling af oplysninger for at vurdere sandsynligheden for, at varianten af interesse er ansvarlig for patientens fænotype og gennemførligheden af en funktionel undersøgelse i Drosophila, (2) indsamling eksisterende genetiske værktøjer og etablering af nye, og (3) udførelse af funktionelle undersøgelser in vivo. Det tredje element kan yderligere opdeles i to underelementer baseret på, hvordan funktionen af en variant af interesse kan vurderes (redningsforsøg eller overekspressions baserede strategier). Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan tilpasses og optimeres til mange scenarier uden for sjældne monogen sygdoms forskning (f. eks. almindeligt forekommende sygdomme, interaktioner mellem gener og miljø og farmakologiske/genetiske skærme for at identificere terapeutiske mål). Evnen til at bestemme variabilitet og patogenicitet af varianter vil ikke kun gavne patienten af interesse ved at give præcise molekylære diagnose, men vil også have en bredere indvirkning på både translationel og grundlæggende videnskabelig forskning.
Eksperimentelle undersøgelser med Drosophila melanogaster giver et robust analyse system til at vurdere konsekvenserne af sygdomsrelaterede humane varianter. Dette skyldes den store mængde af viden og forskellige genetiske værktøjer, der er blevet genereret af mange forskere i flue marken i løbet af de sidste århundrede89. Ligesom ethvert andet eksperimentelt system er det imidlertid vigtigt at erkende de forbehold og begrænsninger, der findes.
F…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jose Salazar, Julia Wang, og Dr. Karen Schulze for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender DRs. ning Liu og XI Luo for den funktionelle karakterisering af de TBX2 varianter, som diskuteres her. Udiagnosticerede sygdomme netværk model organismer screening Center blev støttet gennem National Institutes of Health (NIH) fælles fond (U54 NS093793). H. T. C. blev yderligere støttet af NIH [CNCDP-K12 og NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research tilskud), Burroughs Wellcome fond (Career Award for medicinske videnskabsfolk), Child Neurology Society og Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) og NIH-direktørens tidlige uafhængigheds pris (DP5 OD026426). M. F. W. blev yderligere støttet af Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. blev yderligere støttet af NIH (R01 DC014932), Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer’s Association (ny investigator forskning Grant: 15-364099), naman Familiefond for grundforskning, og Caroline Wiess lov fond for forskning i Molekylær medicin. Confocal mikroskopi hos BCM understøttes delvist af NIH Grant U54HD083092 til Neuro visualiserings kernen for intellektuel og udviklingsmæssige handicap Research Center (iddrc).
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
Plasmid DNA | |||
Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
Molecular biology kits and reagents | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
Electroretinogram Rig related equipment | |||
ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |