JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Målet med detta protokoll är att beskriva utformningen och utförandet av in vivo-experiment i Drosophila melanogaster för att bedöma de funktionella konsekvenserna av sällsynta genvarianter förknippade med mänskliga sjukdomar.

Abstract

Framsteg inom sekvenserings teknik har gjort hela-genomet och hela-exome dataset mer tillgängliga för både klinisk diagnos och avancerad humangenetik forskning. Även om ett antal i silico-algoritmer har utvecklats för att förutsäga patogeniteten hos varianter som identifierats i dessa dataset, är funktionella studier avgörande för att fastställa hur specifika genomiska varianter påverkar protein funktionen, särskilt för genom Varianter. I nätverket för odiagnostiserade sjukdomar (UDN) och andra forsknings konsorer för sällsynta sjukdomar, modellorganismer (MO) inklusive Drosophila, C. elegans, zebrafisk och möss används aktivt för att bedöma funktionen hos den förmodade humana Varianter. Detta protokoll beskriver en metod för funktionell bedömning av sällsynta humana varianter som används i modellorganismerna screening Center Drosophila kärna av UDN. Arbetsflödet börjar med att samla in Human-och MO-information från flera offentliga databaser, med hjälp av MARRVEL-webbresursen för att bedöma om varianten sannolikt kommer att bidra till patientens tillstånd samt utforma effektiva experiment baserade på tillgängliga kunskap och resurser. Därefter genereras genetiska verktyg (t. ex. T2A-GAL4 och UAS-Human cDNA-linjer) för att bedöma funktionerna hos varianter av intresse i Drosophila. Vid utveckling av dessa reagenser, två-pronged funktionella analyser baserade på räddning och överuttryck experiment kan utföras för att bedöma variant funktion. I räddnings grenen är de endogena fluggener “humaniserade” genom att ersätta den ortologösa Drosophila genen med referens eller variant mänskliga transgener. I överuttryck grenen, referens och variant mänskliga proteiner är exogent drivs i en mängd olika vävnader. I båda fallen kan varje och fenotyp (t. ex. dödlighet, ögonmorfologi, elektrofysiologi) användas som en avläsnings bar, oberoende av den sjukdom av intresse. Skillnader observerade mellan referens och variant alleler föreslå en variant-specifik effekt, och därmed sannolik patogenicitet. Detta protokoll möjliggör snabba, in vivo-bedömningar av förmodade sjukdomsframkallande varianter av gener med kända och okända funktioner.

Introduction

Patienter med sällsynta sjukdomar genomgår ofta en mödosam resa kallad “Diagnostic Odyssey” för att få en korrekt diagnos1. De flesta sällsynta sjukdomar tros ha ett starkt genetiskt ursprung, vilket gör genetiska/genomiska analyser kritiska delar av den kliniska workup. Förutom kandidat gen panel sekvensering och kopiera nummer variation analys baserad på kromosomala mikromatriser, hela-exome (WES) och hela-Genome sekvensering (WGS) teknik har blivit alltmer värdefulla verktyg under det senaste decenniet2, 3. För närvarande, diagnostisk frekvens för att identifiera en känd patogena variant i Wes och WGS är ~ 25% (högre i pediatriska fall)4,5. För de flesta fall som förblir odiagnostiserade efter klinisk WES/WGS, ett vanligt problem är att det finns många kandidat gener och varianter. Nästa generations sekvensering identifierar ofta nya eller Ultra-ovanliga varianter i många gener, och att tolka om dessa varianter bidrar till sjukdoms fenotyper är utmanande. Till exempel, även om de flesta nonsens eller frameshift mutationer i gener tros vara förlust av funktion (LOF) alleler på grund av nonsens-medierad förfall av kodade transkription, trunkera mutationer som finns i den sista exonerna undkomma denna process och kan fungera som godartad eller Gain-of-funktion (GOF) alleler6.

Dessutom, förutsäga effekterna av en genom allel är en skrämmande uppgift, eftersom det kan resultera i ett antal olika genetiska scenarier som först beskrivs av Herman Muller på 1930-talet (dvs., amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, eller isomorph)7 . Många i silico program och metoder har utvecklats för att förutsäga patogeniteten hos genom varianter baserat på evolutions bevarande, typ av aminosyraförändring, position inom en funktionell domän, allel frekvens i den allmänna befolkningen, och andra parametrar8. Men dessa program är inte en heltäckande lösning för att lösa det komplicerade problemet med variant tolkning. Intressant, en nyligen studie visade att fem i stort sett används variant patogenitet förutsägelse algoritmer (Polyphen9, SIFT10, CADD11, Provean12, mutation taster) överens om patogenicitet ~ 80% av tiden8 . I synnerhet, även när alla algoritmer är överens, returnerar de en felaktig förutsägelse av patogenicitet upp till 11% av tiden. Detta leder inte bara till bristfällig klinisk tolkning utan kan också avskräcka forskare från att följa upp nya varianter genom att felaktigt lista dem som godartade. Ett sätt att komplettera den nuvarande begränsningen i silico modellering är att ge experimentella data som visar effekten av variant funktion in vitro, ex vivo (t. ex., odlade celler, organoider), eller in vivo.

In vivo funktionella studier av sällsynta sjukdomsassocierade varianter i MO har unika styrkor13 och har antagits av många sällsynta sjukdoms forskning initiativ runt om i världen, inklusive odiagnostiserade sjukdomar nätverk (UDN) i USA och sällsynta Sjukdomar modeller & mekanismer (RDMM) nätverk i Kanada, Japan, Europa och Australien14. Utöver dessa samordnade insatser för att integrera MO-forskare i arbetsflödet för diagnostik av sällsynta sjukdomar och mekanistiska studier på nationell nivå har ett antal individuella samarbetsprojekt mellan kliniska forskare och MO-forskarna lett till upptäckten och karakterisering av många nya mänskliga sjukdomsframkallande gener och varianter82,83,84.

I UDN, en centraliserad modell organismer screening Center (MOSC) mottar inlagor av kandidat gener och varianter med en beskrivning av patientens tillstånd och bedömer om varianten är sannolikt att vara patogena med hjälp av informatik verktyg och in vivo Experiment. I fas I (2015-2018) av UDN, MOSC består av en Drosophila kärna [Baylor College of Medicine (BCM)] och Zebrafish Core (University of Oregon) som arbetade tillsammans för att bedöma fall. Med hjälp av informatik analys och ett antal olika experimentella strategier i Drosophila och Zebrafish har Mosc hittills bidragit till diagnosen 132 patienter, identifiering av 31 nya syndrom55, upptäckten av flera nya mänskliga sjukdomsgener (t. ex. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) och fenotypisk expansion av känd sjukdom gener (t. ex. CACNA1AACOX122).

Förutom projekt inom UDN har MOSC Drosophila Core forskare bidragit till nya sjukdomsgen upptäckter i samarbete med centra för Mendelian genomik och andra initiativ (t. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) med samma uppsättning av informatik och genetiska strategier som utvecklats för UDN. Med tanke på betydelsen av MO studier om sällsynta sjukdomar diagnos, MOSC utökades till att omfatta en C. elegans kärna och andra Zebrafish kärna (båda vid Washington University vid St Louis) för fas II (2018-2022) av UDN.

Detta manuskript beskriver ett in vivo funktionella studieprotokoll som aktivt används i UDN Mosc Drosophila Core för att avgöra om genom varianter har funktionella konsekvenser för proteinet av intresse med transgena flugor som uttrycker mänskliga Proteiner. Målet med detta protokoll är att hjälpa MO-forskare att samarbeta med kliniska forskargrupper för att ge experimentella belägg för att en kandidat variant i en gen av intresse har funktionella konsekvenser, vilket underlättar klinisk diagnos. Detta protokoll är mest användbart i ett scenario där en Drosophila forskare kontaktas av en klinisk utredare som har en sällsynt sjukdom patient med en specifik kandidat variant i en gen av intresse.

Detta protokoll kan delas upp i tre delar: (1) samla in information för att bedöma sannolikheten för att den variant av intresse som ansvarar för patientens fenotyp och genomförbarheten av en funktionell studie i Drosophila, (2) insamling befintliga genetiska verktyg och etablera nya, och (3) utföra funktionella studier in vivo. Den tredje delen kan delas upp i två del element som bygger på hur en variant av intresse kan bedömas (räddnings experiment eller överuttrycksbaserade strategier). Det är viktigt att notera att detta protokoll kan anpassas och optimeras till många scenarier utanför sällsynt monogen sjukdom forskning (t. ex., vanliga sjukdomar, gen-miljö interaktioner, och farmakologiska/genetiska skärmar för att identifiera terapeutiska mål). Möjligheten att fastställa varianternas funktionalitet och patogenicitet kommer inte bara att gynna patienten av intresse genom att tillhandahålla korrekt molekylär diagnos utan också ha bredare effekter på både translationell och grundläggande vetenskaplig forskning.

Protocol

1. insamling av human-och MO-information för att bedöma sannolikheten för att en variant av intresset är ansvarig för sjukdomens fenotyper och genomförbarheten av funktionella studier i Drosophila Utföra omfattande databas-och litteratursökningar för att avgöra om de specifika gener och varianter av intresse är bra kandidater för att förklara fenotyp av patienten av intresse. Samla in följande information specifikt. Bedöma om genen av intresse har tidigare vari…

Representative Results

Funktionell studie av de Novo missense variant i EBF3 kopplad till neuroutvecklingsrelaterade fenotyperI en 7-årig hane med neuroutvecklande fenotyper inklusive hypotoni, ataxi, global utvecklingsförsening, och expressiv talsvårigheter, läkare och mänskliga genetiker vid National Institutes of Health odiagnostiserade sjukdomar Project (UDP) identifierade en de Novo genom variant (p. R163Q) i EBF3 (tidig b-cells faktor 3)15, en gen som kodar en C…

Discussion

Experimentella studier med Drosophila melanogaster ger ett robust analyssystem för att bedöma konsekvenserna av sjukdomsassocierade mänskliga varianter. Detta beror på den stora mängden kunskap och olika genetiska verktyg som har genererats av många forskare i flug fältet under det senaste århundradet89. Precis som alla andra experimentella system är det dock viktigt att erkänna de förbehåll och begränsningar som finns.

Varningar i samband …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Jose Salazar, Julia Wang, och Dr Karen Schulze för kritisk läsning av manuskriptet. Vi erkänner DRS. ning LiU och XI Luo för funktionell karakterisering av de TBX2 varianter som diskuteras här. Odiagnostiserade sjukdomar nätverk modell organismer screening Center stöddes genom National Institutes of Health (NIH) gemensamma fonden (U54 NS093793). H. T. C. stöddes ytterligare av NIH [CNCDP-K12 och NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (neurovetenskap Research Grant), Burroughs Wellcome Fund (karriär pris för medicinska forskare), Child neurologi Society och Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) och NIH-direktörens tidiga självständighets utmärkelse (DP5 OD026426). M. F. W. stöddes ytterligare av Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. stöddes ytterligare av NIH (R01 DC014932), The Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer ‘ s Association (ny utredare forskningsstipendium: 15-364099), Naman familj Fund för grundforskning, och Caroline Wiess Law Fund för forskning i Molekylär medicin. Konfokalmikroskopi på BCM stöds delvis av NIH Grant U54HD083092 till intellektuella och utvecklingsstörning Research Center (IDDRC) Neurovisualisering kärna.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genética. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genética. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genética. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genética. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genética. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Biologia do Desenvolvimento. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image