Isolering og kultur av primær aorta endothelial celler fra miniatyr griser
Summary
En effektiv enzymatisk metode for isolering av primær svin aorta endothelial celler (pAECs) fra miniatyr griser er beskrevet. Den isolerte primære pAECs kan brukes til å undersøke immun-og blødnings responsen i xenotransplantation.
Abstract
Xenotransplantation er en lovende måte å løse mangelen på menneskelige organer for pasienter med sluttfasen organ svikt, og grisen er betraktet som en passende organ kilde. Immun avvisning og-blødnings er to store hekk for suksessen til xenotransplantation. Vaskulær endothelial celle (EC) skade og dysfunksjon er viktig for utviklingen av betennelse og blødnings responser i xenotransplantation. Således er isolering av svin aorta endothelial celler (pAECs) nødvendig for å undersøke immun avvisning og blødnings responser. Her har vi utviklet en enkel enzymatisk tilnærming for isolering, karakterisering, og utvidelse av svært renset pAECs fra miniatyr griser. Først ble miniatyr grisen anesteserte med Ketamin, og en lengde av aorta var excised. For det andre, den endothelial overflaten av aorta ble eksponert for 0,005% kollagenase IV fordøyelseskanal løsning i 15 min. tredje, den endothelial overflaten av aorta ble skrapet i bare én retning med en celle skraper (< 10 ganger), og ble ikke komprimert under prosessen med Skraping. Til slutt ble den isolerte pAECs av dag 3, og etter passering 1 og passasje 2, identifisert ved flyt flowcytometri med et anti-CD31 antistoff. Prosentene av CD31-positive celler var 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1%, og 92,4% ± 1,7% (gjennomsnittlig ± SD), henholdsvis. Konsentrasjonen av Kollagenase IV, fordøyelses tiden, retningen og hyppigheten og intensiteten av skraping er avgjørende for å redusere Fibroblast forurensning og oppnå høy renhet og et stort antall ECs. Som konklusjon, er vår enzymatisk metode en svært effctive metode for å isolere ECs fra miniatyr gris aorta, og cellene kan utvides in vitro for å undersøke immunforsvaret og blødnings responser i xenotransplantation.
Introduction
Mangelen på tilgjengelige organer for transplantasjon er et fremragende problem World-Wide1. Ifølge Røde Kors Society of China, fikk bare et lite antall pasienter med slutt-fase orgel svikt et passende organ i Kina i 2018.
Xenotransplantation er en lovende måte å løse problemet med orgel mangel. Gris organer anses å være den mest egnede organer for mennesker på grunn av anatomiske og fysiologiske likheter2,3. Svikt i en gris xenograft er i stor grad knyttet til primater immun avvisning og blødnings responser. Svin endothelial Cells (ECs) er kritiske fordi disse cellene er de første til å samhandle med primater immunsystem, som inkluderer antistoff, komplement, cytokiner, og immunceller (f. eks, T celler, B celler, og makrofager)4,5. Svin ECs spiller en viktig rolle i gris orgel og Holme xenotransplantation6,7. Dermed ECs er viktige celler for å undersøke avvisning og blødnings reaksjoner på en gris pode. Isolering av høy kvalitet svin ECs er nødvendig for xenotransplantation forskning.
I forsøk på å isolere ECs fra forskjellige organer (f.eks. hjerte, nyre, lever og aorta) har flere protokoller blitt rapportert i en xenotransplant innstilling8,9, 10,11,12. Men å holde en ultrarent kultur av isolerte ECs er et fremragende problem i standardprotokoller. Den økte konsentrasjonen av fordøyd løsningen, upassende fordøyelsen tid og skrape intensitet kan bidra til økt Fibroblast forurensning i dagens studier8,10,13. For resten, metoden av isolere pAECs fra miniatyr Pigs er færre studert. Her beskriver vi en optimalisert enzymatisk metode for å isolere svært renset pAECs fra miniatyr griser (Wuzhishan eller Bama). Flere trinn i protokollen er utformet for å redusere Fibroblast forurensning og oppnå ECs med høy renhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endothelial celler er ofte brukt i forskning av vaskulær dysfunksjon, diabetes, vev gjenfødelse, transplantasjon, og kreft14,15,16,17,18. Å forstå og karakterisere biologi og funksjon av ECs i disse sykdommene, mange metoder for å isolere ECS av ulike syke organer eller vev har blitt rapportert8,19</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisinsk vitenskapelig forskning stiftelsen av Guangdong-provinsen, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation for vitenskap og teknologi, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 og JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Foundation for vitenskap og teknologi, Grant/Award nummer: 2017013; Nasjonal nøkkel R & D program i Kina, Grant/Award nummer: 2017YFC1103704; Sanming prosjekt av medisin i Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Spesielle midler for bygging av høyt nivå sykehus i Guangdong-provinsen (2019); Fondet for High Level medisinsk disiplin bygging av Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Foundation av helse og familieplanlegging Commission, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 og SZXJ2018059. Vi takker Hancheng Zhang og Zhicheng Zou fra Shenzhen University for å bistå i utarbeidelsen av manuskriptet.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
Referências
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Bioquímica. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
