Isolation og kultur af primære aorta endotelceller fra miniature grise
Summary
Der er beskrevet en effektiv enzymatisk metode til isolering af primære svin aorta endotheliale celler (pAECs) fra miniature grise. De isolerede primære pAECs kan anvendes til at undersøge immun-og koagulations reaktionen i xenotransplantation.
Abstract
Xenotransplantation er en lovende måde at løse manglen på menneskelige organer til patienter med slutstadiet organsvigt, og grisen betragtes som en egnet organ kilde. Immun afvisning og Koagulering er to store forhindringer for xenotransplantations succes. Vaskulær endotelcelle (EC) skade og dysfunktion er vigtige for udviklingen af inflammation og koagulations respons i xenotransplantation. Således isolering af svin aorta endotelceller (pAECs) er nødvendig for at undersøge immun afvisning og koagulations reaktioner. Her har vi udviklet en simpel enzymatisk tilgang til isolation, karakterisering og udvidelse af højt oprensede pAECs fra miniature grise. For det første blev miniature grisen bedøvet med ketamin, og en længde på aorta blev fjernet. For det andet blev den endotelale overflade af aorta udsat for 0,005% kollagenase IV fordøjelsesvæske opløsning i 15 min. for det tredje blev den endotelale overflade af aorta skrabet i kun én retning med en celle skraber (< 10 gange), og blev ikke komprimeret under processen med Skrabning. Endelig blev de isolerede pAECs af dag 3, og efter passage 1 og passage 2, identificeret ved flow cytometri med et anti-CD31-antistof. Procentdelen af CD31-positive celler var henholdsvis 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% og 92,4% ± 1,7% (gennemsnit ± SD). Koncentrationen af collagenase IV, fordøjelses tiden, retningen, og hyppigheden og intensiteten af skrabning er afgørende for faldende fibroblast forurening og opnåelse af høj renhed og et stort antal ECs. Afslutningsvis er vores enzymatiske metode en meget virkningsfuld metode til isolering af ECs fra miniature svinet aorta, og cellerne kan ekspanderes in vitro for at undersøge immun-og koagulations responset i xenotransplantation.
Introduction
Manglen på tilgængelige organer til transplantation er et udestående problem på verdensplan1. Ifølge Røde Kors Society i Kina, kun et lille antal patienter med slutstadiet organsvigt modtaget et passende organ i Kina i 2018.
Xenotransplantation er en lovende måde at løse problemet med organmangel på. Svine organer anses for at være de mest egnede organer for mennesker på grund af anatomiske og fysiologiske ligheder2,3. Svigt af et svine xenograft er i vid udstrækning relateret til primat immun afstødning og koagulations respons. Porcin endotelceller (ECs) er kritiske, da disse celler er de første til at interagere med primat immunsystemet, som omfatter antistof, komplement, cytokiner og immunceller (f. eks. T-celler, B-celler og makrofager)4,5. Porcin ECs spiller en afgørende rolle i svine orgel og ø-xenotransplantation6,7. Således, ECs er vigtige celler til at undersøge afvisning og koagulations reaktioner på en gris transplantat. Der kræves isolering af svin af høj kvalitet til xenotransplantations forskning.
I forsøg på at isolere ECs fra forskellige organer (f. eks. hjerte, nyrer, lever og aorta) er der rapporteret om flere protokoller i en xenotransplantations indstilling8,9,10,11,12. Men at holde en ultrabure kultur af isolerede ECs er et udestående problem i standardprotokoller. Den øgede koncentration af den Ford øjede opløsning, uhensigtsmæssig fordøjelsestid og skrabe intensitet kan bidrage til den øgede fibroblast kontaminering i de nuværende undersøgelser8,10,13. Desuden er metoden med isolerede pAECs fra miniature grise mindre undersøgt. Her beskriver vi en optimeret enzymatisk metode til isolering af højt oprensede pAECs fra miniature grise (Wuzhishan eller BAMA). Flere trin i protokollen er designet til at reducere fibroblast kontaminering og opnå høj renhed ECs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endotelceller er almindeligt anvendt i forskning af vaskulær dysfunktion, diabetes, vævsregenerering, transplantation, og kræftformer14,15,16,17,18. At forstå og karakterisere biologi og funktion af ECS i disse sygdomme, talrige metoder til at isolere ECS af forskellige syge organer eller væv er blevet rapporteret8,<sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Grant/bonusnummer: 2016A030313028; Medicinsk videnskabelig forskning Foundation af Guangdong-provinsen, Grant/bonusnummer: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/bonusnummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 og JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Foundation for videnskab og teknologi, Grant/bonusnummer: 2017013; National Key R & D program i Kina, Grant/bonusnummer: 2017YFC1103704; Sanming projekt af medicin i Shenzhen, Grant/bonusnummer: SZSM201412020; Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen (2019); Fond for højt niveau medicinsk disciplin opførelse af Shenzhen, Grant/bonusnummer: 2016031638; Shenzhen Foundation for sundhed og familieplanlægning provision, Grant/tildeling nummer: SZXJ2017021 og SZXJ2018059. Vi takker Hancheng Zhang og Zhicheng Zou fra Shenzhen University for at hjælpe med forberedelsen af manuskriptet.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
Referências
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution?. Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma – An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Bioquímica. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
