En Microfluidic platform til stimulering af chondrocytter med dynamisk kompression
Summary
Denne artikel indeholder detaljerede metoder til at fabrikere og karakterisere en pneumatisk aktivering mikrofluidisk enhed til af kompression.
Abstract
Mekaniske stimuli er kendt for at moduere biologiske funktioner af celler og væv. Nylige undersøgelser har antydet, at trykkende stress ændrer vækst plade brusk arkitektur og resulterer i vækst graduering af lange knogler af børn. For at bestemme rollen for trykbærende stress i knoglevækst, skabte vi en mikrofluidisk-enhed, der aktiveres af pneumatisk tryk, til dynamisk (eller statisk) komprimering af vækstpladen chondrocytter indlejret i alginat hydrogel cylindre. I denne artikel beskriver vi detaljerede metoder til opdigte og karakterisering af denne enhed. Fordelene ved vores protokol er: 1) fem forskellige størrelser af kompressions stress kan genereres på fem tekniske replikater i en enkelt platform, 2) det er nemt at visualisere celle morfologi via et konventionelt lys mikroskop, 3) celler kan hurtigt isoleres fra enheden efter komprimering for at lette downstream-assays, og 4) platformen kan anvendes til at studere mechanobiologi af enhver celletype, der kan vokse i hydrogels.
Introduction
Mikrokonstruerede platforme er værdifulde værktøjer til at studere Molekylær, cellulær og vævsniveau biologi, fordi de muliggør dynamisk kontrol af både de fysiske og kemiske mikromiljøer1,2,3 ,4,5,6,7,8. Således kan flere hypoteser testes samtidigt på en stramt kontrolleret måde. I tilfælde af vækst plade brusk, der er stigende beviser for en vigtig rolle i trykkende stress i modulering knoglevækst gennem handling på vækstpladen brusk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men virkningsmekanismen af kompressions stress-især, hvordan stress guider dannelsen af af kolonner i vækstpladen-er dårligt forstået.
Formålet med denne protokol er at skabe en pneumatisk aktuerende mikrofluidisk af kompressionsanordning26 for at belyse mekanismerne for mekanismebiologi i vækstpladen chondrocytter (figur 1a-c). Anordningen består af to dele: den pneumatiske aktuerings enhed og alginatgel konstruktionen. Den mikrofluidiske pneumatiske aktuerings enhed er fremstillet ved hjælp af Polydimethylsiloxan (PDMS) baseret på foto-og Soft-litografi. Denne enhed indeholder en 5 x 5 array af tynde PDMS membran balloner, som kan oppustet forskelligt baseret på deres diametre. Alginat gel konstruktionen består af chondrocytter indlejret i en 5 x 5 matrix af alginat gel cylindre, og hele alginat-chondrocyte konstruktioner samles med aktuerings enheden. Alginat gel-konstrukterne komprimeres af de pneumatisk oppustet PDMS-balloner (figur 1b). Den mikrofluidisk enhed kan generere fem forskellige niveauer af tryk belastning samtidigt i en enkelt platform baseret på forskelle i PDMS ballon diameter. Således er en høj gennemløb test af af mechanobiology under flere kompressionsforhold muligt.
Den mikrofluidisk-enhed, der er beskrevet i denne protokol, har mange fordele i forhold til den konventionelle kompressionsanordning, såsom eksterne fixatorer14,21,23 og makroskopiske kompressions anordninger16, 19 , 27 , 28 for at studere af mechanobiology: 1) er den mikrofluidiske enhed omkostningseffektiv, fordi den bruger mindre mængder af prøver end den makroskopiske kompressionsanordning, 2) den mikrofluidiske enhed er tidseffektiv, fordi den kan teste flere kompressionsforhold samtidigt, 3) den mikrofluidisk enhed kan kombinere mekaniske og kemiske stimuli ved at danne en koncentration gradient af kemikalier baseret på den begrænsede blanding i mikrokanaler, og 4) forskellige mikroskopi teknikker (time-lapse mikroskopi og fluorescens Konfokal mikroskopi) kan anvendes med den mikrofluidisk enhed lavet af gennemsigtige PDMS.
Vi har vedtaget og modificeret metoden til Moraes et al.7,29 at skabe forskellige trykkende stress niveauer i en enkelt enhed for at muliggøre High-gennemløb mechanobiology undersøgelser af af kompression. Vores tilgang er passende for celler (f. eks. chondrocytter), som har brug for tredimensionale (3D) kultur miljø og for biologiske assays efter komprimering af celler. Selv om nogle mikrofluidiske celle kompressions anordninger kan komprimere celler, der dyrkes på to-dimensionelle (2D) substrater30,31,32, kan de ikke bruges til chondrocytter, fordi 2D-dyrkede chondrocytter dedifferentiere. Der er mikrofluidiske platforme til komprimering af 3D-dyrkede celler i photopolymerized silicagelrogeler7,33, men de er begrænsede i isolerende celler efter komprimering eksperimenter, fordi isolerende celler fra photopolymeriseret hydrogel er ikke let. Desuden, virkningerne af ultraviolet (UV) eksponering og foto binding initiatorer på celler kan være nødvendigt at blive evalueret. I modsætning hertil tillader vores metode hurtig isolering af celler efter kompression eksperimenter for post biologiske assays, fordi alginat silicagelrogeler kan depolymeriseres hurtigt af calciumchelatorer. Den detaljerede anordning fabrikation og karakterisering metoder er beskrevet i denne protokol. I figur 2vises en kort procedure for opdigte af mikrofluidisk af kompressionsanordning.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at teste effekten af tryk belastning på vækstpladen chondrocytter, udviklede vi mikrofluidisk af kompressionsanordning (figur 1) for at anvende forskellige niveauer af kompressions stress til chondrocytter i alginat hydrogel stilladset for 3D kultur i høj kapacitet. For at hjælpe andre forskere til at vedtage vores enhed eller til at udvikle lignende enheder, vi leverede oplysninger om indretningen fabrikation trin i denne protokol artikel.
De afgørende s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker DRs. Christopher Moraes og Stephen A. Morin for deres støtte til indretningen design og fabrikation. Denne undersøgelse blev støttet af Bioengineering for human Health Grant fra University of Nebraska-Lincoln (UNL) og University of Nebraska Medical Center (UNMC), og Grant AR070242 fra NIH/NIAMS. Vi takker Janice A. Taylor og James R. Talaska fra Advanced Micro scopy Core Facility på University of Nebraska Medical Center for at yde assistance med confokal mikroskopi.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
Referências
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
