Une plate-forme microfluidique pour stimuler les chondrocytes avec compression dynamique
Summary
Cet article fournit des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser un dispositif microfluidique pneumatiquement actionnant pour la compression de chondrocyte.
Abstract
Les stimuli mécaniques sont connus pour moduler les fonctions biologiques des cellules et des tissus. Des études récentes ont suggéré que le stress compressif modifie l’architecture du cartilage de la plaque de croissance et entraîne la modulation de la croissance des os longs des enfants. Pour déterminer le rôle du stress compressif dans la croissance osseuse, nous avons créé un dispositif microfluidique actionné par pression pneumatique, pour comprimer dynamiquement (ou statiquement) les chondrocytes de plaque de croissance incorporés dans les cylindres d’hydrogel d’alginate. Dans cet article, nous décrivons des méthodes détaillées pour fabriquer et caractériser cet appareil. Les avantages de notre protocole sont les : 1) Cinq différentes magnitudes de stress compressif peuvent être générées sur cinq répliques techniques dans une seule plate-forme, 2) Il est facile de visualiser la morphologie cellulaire par l’intermédiaire d’un microscope à lumière classique, 3) Les cellules peuvent être rapidement isolées de l’appareil après compression pour faciliter les essais en aval, et 4) La plate-forme peut être appliquée pour étudier la mécanobiologie de tout type de cellule qui peut se développer dans les hydrogels.
Introduction
Les plates-formes micro-ingénierie sont des outils précieux pour étudier la biologie moléculaire, cellulaire et tissulaire parce qu’elles permettent le contrôle dynamique des microenvironnements physiques et chimiques1,2,3 ,4,5,6,7,8. Ainsi, plusieurs hypothèses peuvent être testées simultanément d’une manière étroitement contrôlée. Dans le cas du cartilage de plaque de croissance, il y a de plus en plus d’évidences d’un rôle important de l’effort compressif en modulant la croissance d’os par l’action sur le cartilage de plaque de croissance9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Cependant, le mécanisme d’action du stress compressif – en particulier, comment le stress guide la formation de colonnes de chondrocytes dans la plaque de croissance – est mal compris.
L’objectif de ce protocole est de créer un dispositif de compression de chondrocyte suffoquement pneumatique26 pour élucider les mécanismes de la mécanobiologie dans les chondrocytes de plaque de croissance(figure 1a-c). Le dispositif se compose de deux parties : l’unité pneumatique d’actionnement et la construction de gel d’alginate. L’unité d’actionnement pneumatique microfluidique est fabriquée à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir de la photo et de la lithographie douce. Cette unité contient un tableau de 5 x 5 de minces ballons à membrane PDMS qui peuvent être gonflés différemment en fonction de leurs diamètres. La construction de gel d’alginate se compose des chondrocytes incorporés dans un tableau 5 x 5 des cylindres de gel d’alginate, et les constructions entières d’alginate-chondrocyte sont assemblées avec l’unité d’actionnement. Les constructions de gel d’alginate sont comprimées par les ballons PDMS gonflables pneumatiquement (figure 1b). Le dispositif microfluidique peut générer cinq niveaux différents de stress compressif simultanément dans une seule plate-forme basée sur les différences dans le diamètre du ballon PDMS. Ainsi, un essai à haut débit de la mécanobiologie de chondrocyte dans des conditions multiples de compression est possible.
Le dispositif microfluidique décrit dans ce protocole a beaucoup d’avantages au-dessus du dispositif conventionnel de compression tel que les fixateurs externes14,21,23 et les dispositifs macroscopiques de compression16, 19 ans, états-unis qui , 27 Annonces , 28 pour l’étude de la mécanobiologie du chondrocyte : 1) L’appareil microfluidique est rentable parce qu’il consomme un plus petit volume d’échantillons que le dispositif de compression macroscopique, 2) L’appareil microfluidique est efficace dans le temps parce qu’il peut tester plusieurs conditions de compression simultanément, 3) Le dispositif microfluidique peut combiner des stimuli mécaniques et chimiques en formant un gradient de concentration de produits chimiques basés sur le mélange limité dans les microcanaux, et 4) Diverses techniques de microscopie (time-lapse microscopie et fluorescence microscopie confocale) peut être appliquée avec le dispositif microfluidique fait de PDMS transparent.
Nous avons adopté et modifié la méthode de Moraes et coll.7,29 pour créer différents niveaux de stress compressif dans un seul appareil pour permettre des études de mécanobiologie à haut débit de la compression du chondrocyte. Notre approche est appropriée pour les cellules (p. ex. les chondrocytes) qui ont besoin d’un environnement culturel tridimensionnel (3D) et pour les essais biologiques après la compression des cellules. Bien que certains dispositifs de compression de cellules microfluidiques puissent comprimer des cellules cultivées sur des substrats bidimensionnels (2D)30,31,32, ils ne peuvent pas être employés pour des chondrocytes parce que les chondrocytes cultivés 2D dédifférencier. Il existe des plates-formes microfluidiques pour la compression des cellules cultivées en 3D dans les hydrogels photopolyisés7,33, mais elles sont limitées dans l’isolation des cellules après des expériences de compression parce que l’isolation des cellules de photopolymérisés hydrogel n’est pas facile. En outre, les effets de l’exposition aux ultraviolets (UV) et des initiateurs de liaisons photo sur les cellules peuvent devoir être évalués. En revanche, notre méthode permet l’isolement rapide des cellules après des expériences de compression pour les essais post-biologiques parce que les hydrogels d’alginate peuvent être dépolymétés rapidement par des chélateurs de calcium. Les méthodes détaillées de fabrication et de caractérisation des appareils sont décrites dans ce protocole. Une brève procédure de fabrication du dispositif de compression microfluidique de chondrocyte est montrée dans la figure 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour tester les effets du stress compressif sur les chondrocytes de plaque de croissance, nous avons développé le dispositif microfluidique de compression de chondrocyte (Figure 1) pour appliquer divers niveaux de stress compressif aux chondrocytes dans l’échafaudage d’hydrogel d’alginate pour 3D culture de manière à haut débit. Pour aider d’autres chercheurs à adopter notre appareil ou à développer des dispositifs similaires, nous avons fourni des détails sur les étapes de fabric…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs Christopher Moraes et Stephen A. Morin pour leur soutien à la conception et à la fabrication d’appareils. Cette étude a été soutenue par la subvention de bioengineering for Human Health de l’Université du Nebraska-Lincoln (UNL) et de l’Université du Nebraska Medical Center (UNMC), et l’AR070242 du NIH/NIAMS. Nous remercions Janice A. Taylor et James R. Talaska de l’Advanced Microscopy Core Facility du Centre médical de l’Université du Nebraska d’avoir fourni de l’aide en microscopie confocale.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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