En Mikrovæskebasert plattform for stimulerende chondrocytes med dynamisk kompresjon
Summary
Denne artikkelen inneholder detaljerte metoder for fabrikere og karakteriserer en pneumatisk actuating mikrovæskebasert enhet for chondrocyte komprimering.
Abstract
Mekaniske stimuli er kjent for å modulere biologiske funksjoner av celler og vev. Nyere studier har antydet at kompresjons stress endrer vekst plate brusk arkitektur og resultater i vekst modulering av lange bein av barn. For å bestemme hvilken rolle kompresjons stress i bein vekst, skapte vi en mikrovæskebasert enhet betjenes av pneumatisk trykk, til dynamisk (eller statisk) komprimere vekst plate chondrocytes innebygd i alginat hydrogel sylindere. I denne artikkelen beskriver vi detaljerte metoder for fabrikere og karakteriserer av denne enheten. Fordelene med vår protokoll er: 1) fem forskjellige magnitudes av kompresjons stress kan genereres på fem tekniske replikerer i en enkelt plattform, 2) det er lett å visualisere celle morfologi via en konvensjonell lys mikroskop, 3) celler kan raskt isoleres fra enheten etter komprimering for å lette nedstrøms analyser, og 4) plattformen kan brukes til å studere mechanobiology av enhver celle type som kan vokse i hydrogeler.
Introduction
Mikro-konstruert plattformer er verdifulle verktøy for å studere molekylær, cellular, og vev nivå biologi fordi de gir dynamisk kontroll av både fysiske og kjemiske microenvironments1,2,3 ,4,5,6,7,8. Dermed kan flere hypoteser testes samtidig på en strengt kontrollert måte. I tilfelle av vekst plate brusk, det er økende bevis på en viktig rolle kompresjons stress i modulerende bein vekst gjennom aksjon på veksten plate brusk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men virkningsmekanismen av kompresjons stress – spesielt, hvordan stress guider dannelsen av chondrocyte søyler i vekst platen – er dårlig forstått.
Målet med denne protokollen er å skape en pneumatisk actuating mikrovæskebasert chondrocyte komprimering enhet26 til belyse mekanismer for mechanobiology i vekst plate chondrocytes (figur 1a-c). Enheten består av to deler: den pneumatiske aktiverings enheten og den alginat gel. Den mikrovæskebasert pneumatiske aktiverings enheten er fabrikkert ved hjelp av Polydimethylsiloxan (PDMS) basert på foto-og Soft-litografi. Denne enheten inneholder en 5 x 5 rekke tynne PDMS membran ballonger som kan blåses opp forskjellig basert på deres diameter. Den alginat gel konstruere består av chondrocytes innebygd i en 5 x 5 rekke alginat gel sylindere, og hele alginat-chondrocyte konstruksjoner er montert med aktivering enhet. De alginat gel konstruerer er komprimert av pneumatisk oppblåst PDMS ballonger (figur 1B). Den mikrovæskebasert enheten kan generere fem forskjellige nivåer av kompresjons stress samtidig i en enkelt plattform basert på forskjeller i PDMS ballong diameter. En høy gjennomstrømmings test av chondrocyte mechanobiology under flere kompresjonsforhold er således mulig.
Mikrovæskebasert-enheten som beskrives i denne protokollen, har mange fordeler i forhold til den konvensjonelle komprimerings enheten, for eksempel eksterne fixators14,21,23 og makroskopisk komprimerings enheter16, 19 andre priser , 27 andre priser , 28 for å studere chondrocyte mechanobiology: 1) mikrovæskebasert enheten er kostnadseffektiv fordi den bruker mindre volum av prøver enn makroskopisk komprimerings enhet, 2) mikrovæskebasert enheten er tid effektiv fordi den kan teste flere kompresjonsforhold samtidig, 3) den mikrovæskebasert enheten kan kombinere mekaniske og kjemiske stimuli ved å danne en konsentrasjon gradient av kjemikalier basert på begrenset miksing i microchannels, og 4) ulike mikroskopi teknikker (time-lapse mikroskopi og fluorescens konfokalmikroskopi mikroskopi) kan påføres med mikrovæskebasert enhet laget av transparent PDMS.
Vi vedtok og modifisert metoden for Moraes et al.7,29 for å skape ulike kompresjons stress nivåer i en enkelt enhet for å muliggjøre høy gjennomstrømming mechanobiology studier av chondrocyte kompresjon. Vår tilnærming er hensiktsmessig for celler (f. eks, chondrocytes) som trenger tre-dimensjonale (3D) kulturmiljø og for biologiske analyser etter komprimere celler. Selv om noen mikrovæskebasert celle komprimerings enheter kan komprimere celler kultivert på to-dimensjonale (2D) underlag30,31,32, kan de ikke brukes til chondrocytes fordi 2D kultivert chondrocytes dedifferentiate. Det er mikrovæskebasert plattformer for å komprimere 3D kulturperler celler i photopolymerized hydrogeler7,33, men de er begrenset i isolere celler etter komprimering eksperimenter fordi isolere celler fra photopolymerized hydrogel er ikke lett. I tillegg kan effektene av ultrafiolett (UV) eksponering og foto Cross Linking initiativtakerne på celler må evalueres. I kontrast, vår metode tillater rask isolering av celler etter komprimering eksperimenter for innlegg biologiske analyser fordi alginat hydrogeler kan depolymeriseres raskt av kalsium chelater. De detaljerte metodene for fremstilling og karakterisering av enheter er beskrevet i denne protokollen. En kort prosedyre for fabrikere av mikrovæskebasert chondrocyte komprimerings enhet vises i figur 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å teste effekten av kompresjons stress på vekst plate chondrocytes, utviklet vi mikrovæskebasert chondrocyte komprimerings enhet (figur 1) for å bruke ulike nivåer av kompresjons stress til chondrocytes i alginat hydrogel stillaset for 3D kultur i høy gjennomstrømming måter. For å hjelpe andre forskere med å ta i mot enheten vår eller utvikle lignende enheter, leverte vi detaljer om fremgangsmåten for enhets fabrikasjon i denne protokoll artikkelen.
<p class="jove_content…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker DRS. Christopher Moraes og Stephen A. Morin for deres støtte til enheten design og fabrikasjon. Denne studien ble støttet av bioteknologi for Human Health stipend fra University of Nebraska-Lincoln (UNL) og University of Nebraska Medical Center (UNMC), og gi AR070242 fra NIH/NIAMS. Vi takker Janice A. Taylor og James R. Talaska av Advanced mikroskopi Core Facility ved University of Nebraska Medical Center for å gi assistanse med konfokalmikroskopi mikroskopi.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
Referências
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
