Микрофлюидная платформа для стимулирования хондроцитов с динамическим сжатием
Summary
В этой статье приводятся подробные методы изготовления и характеристики пневматически актуального микрофлюидного устройства для сжатия хондроцитов.
Abstract
Механические стимулы, как известно, модулировать биологические функции клеток и тканей. Недавние исследования показали, что сжатие стресса изменяет архитектуру пластины роста и приводит к модуляции роста длинных костей детей. Чтобы определить роль сжатия в росте костей, мы создали микрофлюидное устройство, действие которого сопровождается пневматическим давлением, чтобы динамически (или статически) сжать рост плиты хондроциты, встроенные в альгинатные гидрогелевые цилиндры. В этой статье мы описываем подробные методы изготовления и характеристики этого устройства. Преимущества нашего протокола: 1) Пять различных величин сжатия стресса могут быть созданы на пяти технических репликатов в одной платформе, 2) Легко визуализировать морфологию клеток с помощью обычного светового микроскопа, 3) Клетки могут быть быстро изолированы от устройства после сжатия для облегчения вниз по течению анализы, и 4) Платформа может быть применена для изучения механобиологии любого типа клеток, которые могут расти в гидрогелях.
Introduction
Микро-инженерные платформы являются ценными инструментами для изучения молекулярной, клеточной и тканевой биологии уровня, поскольку они позволяют динамический контроль как физической и химической микросреды1,2,3 ,4,5,6,7,8. Таким образом, несколько гипотез могут быть одновременно проверены в строго контролируемой манере. В случае роста пластины хряща, Есть все больше доказательств важной роли сжатия стресса в модуляции роста костей через действие на рост пластины хряща9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Однако механизм действия сжимаемого стресса – в частности, как стресс направляет образование хондроцитов в ростовой пластине – плохо понятен.
Целью этого протокола является создание пневматически актуирующего микрофлюидного хондроцитного компрессионного устройства26 для выяснения механизмов механобиологии в хондроцитах пластины роста(рисунок 1a-c). Устройство состоит из двух частей: пневматического актуационного блока и конструкции альгината геля. Микрофлюидный пневматический актуационный блок изготавливается с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) на основе фото- и мягкой литографии. Это устройство содержит 5 х 5 массив тонких PDMS мембранных шаров, которые могут быть завышены по-разному в зависимости от их диаметров. Конструкция гель-альгината состоит из хондроцитов, встроенных в массив альгината гель 5, а все конструкции альгината-хондроцитов собраны с помощью актуационного блока. Конструкции гель альгината сжаты пневматически надутыми воздушными шарами PDMS(рисунок 1b). Микрофлюидическое устройство может генерировать пять различных уровней сжатия одновременно в одной платформе на основе различий в диаметре шарика PDMS. Таким образом, возможно высокое пропускное тестирование хондроцитной механобиологии при множественных условиях сжатия.
Микрофлюидическое устройство, описанное в этом протоколе, имеет много преимуществ перед обычным истрижным устройством сжатия, таким как внешние фиксаторы14,21,23 и макроскопические устройства сжатия16, 19 лет , 27 , 28 для изучения хондроцитов механобиологии: 1) Микрофлюидическое устройство является экономически эффективным, поскольку оно потребляет меньший объем образцов, чем макроскопическое устройство сжатия, 2) Микрофлюидическое устройство является эффективным временем, потому что он может проверить несколько условия сжатия одновременно, 3) Микрофлюидическое устройство может комбинировать механические и химические стимулы, образуя градиент концентрации химических веществ на основе ограниченного смешивания в микроканалах, и 4) Различные методы микроскопии (временной промежуток микроскопии и флуоресценции конфокальной микроскопии) могут быть применены с микрофлюидным устройством из прозрачного PDMS.
Мы приняли и модифицировали метод Moraes et al.7,29 для создания различных уровней сжатия в одном устройстве, чтобы обеспечить высокопроизводительные исследования механобиологии сжатия хондроцитов. Наш подход подходит для клеток (например, хондроцитов), которым необходима трехмерная (3D) культурная среда и для биологических анализов после сжатия клеток. Хотя некоторые микрофлюидные устройства сжатия клеток могут сжимать клетки, культивированные на двухмерных (2D) субстратах30,31,32, они не могут быть использованы для хондроцитов, потому что 2D культивированные хондроциты dedifferentiate. Существуют микрофлюидные платформы для сжатия 3D-культурных клеток в фотополимеризованных гидрогелях7,33,но они ограничены в изоляции клеток после экспериментов по сжатию, потому что изолирующие клетки от фотополимеризованных гидрогель не легко. Кроме того, влияние ультрафиолетового (УФ) воздействия и фото перекрестных инициаторов на клетки, возможно, потребуется оценить. В отличие от этого, наш метод позволяет быструю изоляцию клеток после экспериментов по сжатию для постбиологических анализов, потому что альгинатные гидрогели могут быть быстро деполимеризированы хеляторами кальция. Подробные методы изготовления и характеристики устройства описаны в этом протоколе. Краткая процедура изготовления микрофлюидного устройства сжатия хондроцитов показана на рисунке 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы проверить влияние сжатия на хондроциты пластины роста, мы разработали микрофлюидный хондроцитов компрессионного устройства (Рисунок 1) применять различные уровни сжатия стресса хондроцитов в альгината гидрогель эшафот для 3D культуры высокой пропускной всей Что…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим докторов Кристофера Мораеса и Стивена А. Морина за их поддержку в разработке и изготовлении устройств. Это исследование было поддержано биоинженерии для здоровья человека грант из Университета штата Небраска-Линкольн (UNL) и Университета штата Небраска медицинский центр (UNMC), и грант AR070242 от NIH / NIAMS. Мы благодарим Дженис А. Тейлор и Джеймса Р. Таласу (Janice A. Taylor) и Джеймса Р. Таласу (Janice A. Taylor) из Фонда расширенной микроскопии медицинского центра Университета штата Небраска за помощь в предоставлении помощи в обеспечении конфокальной микроскопии.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
Referências
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
