Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica
Summary
Este artículo proporciona métodos detallados para fabricar y caracterizar un dispositivo microfluídico de accionamiento neumático para la compresión de condrocitos.
Abstract
Se sabe que los estímulos mecánicos modulan las funciones biológicas de las células y los tejidos. Estudios recientes han sugerido que el estrés compresivo altera la arquitectura del cartílago de la placa de crecimiento y resulta en la modulación del crecimiento de los huesos largos de los niños. Para determinar el papel de la tensión compresiva en el crecimiento óseo, creamos un dispositivo microfluídico accionado por presión neumática, para comprimir dinámicamente (o estáticamente) los condrocitos de la placa de crecimiento incrustados en cilindros de hidrogel de alginato. En este artículo, describimos métodos detallados para fabricar y caracterizar este dispositivo. Las ventajas de nuestro protocolo son: 1) Se pueden generar cinco magnitudes diferentes de tensión compresiva en cinco réplicas técnicas en una sola plataforma, 2) Es fácil visualizar la morfología celular a través de un microscopio de luz convencional, 3) Las células pueden aislarse rápidamente desde el dispositivo después de la compresión para facilitar los ensayos aguas abajo, y 4) La plataforma se puede aplicar para estudiar la mecanobiología de cualquier tipo de célula que pueda crecer en hidrogeles.
Introduction
Las plataformas micro-ingeniería son herramientas valiosas para estudiar la biología molecular, celular y de nivel tisular porque permiten el control dinámico de los microambientes físicos y químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Por lo tanto, múltiples hipótesis se pueden probar simultáneamente de una manera estrechamente controlada. En el caso del cartílago de la placa de crecimiento, hay crecientes evidencias de un papel importante de la tensión compresiva en la modulación del crecimiento óseo a través de la acción en el cartílago de la placa de crecimiento9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Sin embargo, el mecanismo de acción del estrés compresivo– en particular, cómo el estrés guía la formación de columnas de condrocitos en la placa de crecimiento – se entiende mal.
El objetivo de este protocolo es crear un dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos de accionamiento neumático26 para dilucidar los mecanismos de mecanobiología en condrocitos de placas de crecimiento(Figura 1a-c). El dispositivo consta de dos partes: la unidad de accionamiento neumático y la construcción del gel de alginato. La unidad de accionamiento neumático microfluídico se fabrica utilizando polidimetilsiloxano (PDMS) basado en la fotolitografía y la litografía blanda. Esta unidad contiene una matriz de 5 x 5 de globos de membrana PDMS delgados que se pueden inflar de manera diferente en función de sus diámetros. La construcción del gel de alginato consiste en los condrocitos incrustados en una matriz de 5 x 5 cilindros de gel de alginato, y todas las construcciones de alginato-condrocitos se ensamblan con la unidad de accionamiento. Las construcciones de gel de alginato son comprimidas por los globos PDMS inflados neumáticamente(Figura 1b). El dispositivo microfluídico puede generar cinco niveles diferentes de tensión de compresión simultáneamente en una sola plataforma en función de las diferencias en el diámetro del globo PDMS. Por lo tanto, una prueba de alto rendimiento de la mecanobiología de condrocitos bajo múltiples condiciones de compresión es posible.
El dispositivo microfluídico descrito en este protocolo tiene muchas ventajas sobre el dispositivo de compresión convencional, como los fijadores externos14,21,23 y los dispositivos de compresión macroscópica16, 19 , 27 , 28 para el estudio de la mecanobiología del condrocitos: 1) El dispositivo microfluídico es rentable porque consume un volumen de muestras más pequeño que el dispositivo de compresión macroscópica, 2) El dispositivo microfluídico es eficaz en el tiempo porque puede probar múltiples condiciones de compresión simultáneamente, 3) El dispositivo microfluídico puede combinar estímulos mecánicos y químicos formando un gradiente de concentración de productos químicos basado en la mezcla limitada en microcanales, y 4) Diversas técnicas de microscopía (time-lapse microscopía microscópica y microscopía confocal de fluorescencia) se puede aplicar con el dispositivo microfluídico hecho de PDMS transparente.
Adoptamos y modificamos el método de Moraes et al.7,29 para crear diferentes niveles de tensión compresiva en un solo dispositivo para permitir estudios de mecanobiología de alto rendimiento de compresión de condrocitos. Nuestro enfoque es apropiado para las células (por ejemplo, condrocitos) que necesitan un entorno de cultivo tridimensional (3D) y para ensayos biológicos después de comprimir las células. Aunque algunos dispositivos de compresión celular microfluídica pueden comprimir células cultivadas en sustratos bidimensionales (2D)30,31,32,no se pueden utilizar para condrocitos porque los condrocitos cultivados 2D desdiferenciado. Existen plataformas microfluídicas para comprimir células cultivadas en 3D en hidrogeles fotopolimerizados7,33,pero están limitadas en el aislando de células después de experimentos de compresión porque aislar las células de fotopolimerizado hidrogel no es fácil. Además, es posible que sea necesario evaluar los efectos de la exposición ultravioleta (UV) y los iniciadores de reticulación foto en las células. Por el contrario, nuestro método permite un rápido aislamiento de las células después de experimentos de compresión para ensayos postbiológicos porque los hidrogeles de alginato pueden ser despolimerizados rápidamente por los quelantes de calcio. Los métodos detallados de fabricación y caracterización del dispositivo se describen en este protocolo. En la Figura 2se muestra un breve procedimiento para fabricar el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para probar los efectos de la tensión compresiva en los condrocitos de la placa de crecimiento, desarrollamos el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos(Figura 1) para aplicar varios niveles de tensión compresiva a los condrocitos en el andamio de hidrogel de alginato para 3D cultura de alto rendimiento. Para ayudar a otros investigadores a adoptar nuestro dispositivo o desarrollar dispositivos similares, proporcionamos detalles de los pasos de fabricación del dispositiv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los doctores Christopher Moraes y Stephen A. Morin su apoyo para el diseño y la fabricación de dispositivos. Este estudio fue apoyado por la beca Bioingeniería para la Salud Humana de la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL) y el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC), y la subvención AR070242 del NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor y James R. Talaska de la Instalación Central de Microscopía Avanzada en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska por proporcionar asistencia con microscopía confocal.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
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