En Mikrofluidisk plattform för att stimulera kondrocyter med dynamisk kompression
Summary
Den här artikeln innehåller detaljerade metoder för att tillverka och karakterisera en pneumatiskt aktiverande mikrofluidisk enhet för Chondrocyte-komprimering.
Abstract
Mekaniska stimuli är kända för att modulera biologiska funktioner av celler och vävnader. Nyligen genomförda studier har föreslagit att kompressiv stress förändrar tillväxtplattan brosk arkitektur och resulterar i tillväxt modulering av långa ben av barn. För att avgöra vilken roll kompressiv stress i bentillväxt, skapade vi en mikroflödessystem enhet aktiveras av pneumatiskt tryck, att dynamiskt (eller statiskt) komprimera tillväxtplattan kondrocyter inbäddade i natriumalginat hydrogel cylindrar. I den här artikeln beskriver vi detaljerade metoder för att tillverka och karakterisera den här enheten. Fördelarna med vårt protokoll är: 1) fem olika magnituder av tryckhållfasthet kan genereras på fem tekniska replikat i en enda plattform, 2) det är lätt att visualisera cellmorfologin via ett konventionellt ljusmikroskop, 3) celler kan snabbt isoleras från enheten efter komprimering för att underlätta nedströms analyser, och 4) plattformen kan tillämpas för att studera mechanobiologi av någon celltyp som kan växa i hydrogels.
Introduction
Mikro-Engineered plattformar är värdefulla verktyg för att studera molekylär, cellulära och vävnadsnivå biologi eftersom de möjliggör dynamisk kontroll av både fysiska och kemiska mikromiljöer1,2,3 ,4,5,6,7,8. Således kan flera hypoteser testas samtidigt på ett väl kontrollerat sätt. När det gäller tillväxtplattan brosk, det finns ökande belägg för en viktig roll av tryckhållfasthet stress i modulerande bentillväxt genom åtgärder på tillväxtplattan brosk9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25. Men verkningsmekanismen för tryckhållfasthet-i synnerhet hur stress styr bildandet av Chondrocyte kolumner i tillväxtplattan-är dåligt förstådd.
Målet med detta protokoll är att skapa en pneumatiskt manövrerande mikrofluidisk Chondrocyte-komprimeringsenhet26 för att belysa mekanismerna för mechanobiologi i tillväxtplattan kondrocyter (figur 1a-c). Anordningen består av två delar: den pneumatiska aktiverings enheten och alginatgelkonstruktionen. Den mikrofluidiska pneumatiska aktiverings enheten är tillverkad med Polydimetylsiloxan (PDMS) baserad på foto-och mjuk litografi. Denna enhet innehåller en 5 x 5 array av tunna PDMS membran ballonger som kan pumpas på olika sätt baserat på deras diameter. Alginatgelkonstruktionen består av de kondrocyter som är inbäddade i en 5 x 5 uppsättning alginatgelcylindrar, och hela alginat-Chondrocyte-konstrukterna monteras med aktiverings enheten. Alginatgelkonstruktioner komprimeras av de pneumatiskt uppblåsta PDMS-ballongerna (figur 1b). Den mikroflödessystem enheten kan generera fem olika nivåer av kompressiv stress samtidigt i en enda plattform baserad på skillnader i PDMS ballong diameter. Således är ett högt genomflöde test av Chondrocyte Mekanobiologi under flera kompressionsförhållanden möjligt.
Den mikroflödessystem anordning beskrev i denne protokoll har många forellerna över den traditionell sammantryckningen anordning sådan som yttre fixeringssystemen14,21,23 och makroskopiska sammantryckningen anordningen16, 19 , 27 , 28 för att studera Chondrocyte mechanobiology: 1) den mikroflödessystem enheten är kostnadseffektiv eftersom den förbrukar mindre volym av prover än den makroskopiska komprimerings enhet, 2) den mikroflödessystem enheten är tidseffektiv eftersom den kan testa flera kompressionsförhållanden samtidigt, 3) den mikroflödessystem enheten kan kombinera mekaniska och kemiska stimuli genom att bilda en koncentration gradient av kemikalier baserade på den begränsade blandningen i mikrokanaler, och 4) olika mikroskopi tekniker (Time-lapse mikroskopi och fluorescenskonfokalmikroskopi) kan appliceras med mikroflödessystem-enheten gjord av transparenta PDMS.
Vi antog och modifierade metoden för Moraes et al.7,29 för att skapa olika tryck stressnivåer i en enda enhet för att möjliggöra hög genomströmning Mekanobiologi studier av Chondrocyte komprimering. Vårt tillvägagångssätt är lämpligt för celler (t. ex. chondrocyter) som behöver tredimensionell (3D) kulturmiljö och för biologiska analyser efter att komprimera celler. Även om vissa mikroflödessystem cell komprimerings enheter kan komprimera celler odlade på tvådimensionella (2D) substrat30,31,32, kan de inte användas för chondrocyter eftersom 2D odlade kondrocyter Dedifferentiering. Det finns mikroflödessystem plattformar för att komprimera 3D odlade celler i photopolymerized hydrogeler7,33, men de är begränsade i isolerar celler efter kompressions experiment eftersom isolera celler från photopolymerized hydrogel är inte lätt. Dessutom kan effekterna av ultraviolett (UV) exponering och foto crosslinking initierare på celler behöva utvärderas. I kontrast, vår metod tillåter snabb isolering av celler efter kompressions experiment för post biologiska analyser eftersom natriumalginat hydrogeler kan depolymeriseras snabbt av kalciumkelatorer. De detaljerade metoderna för enhets tillverkning och karakterisering beskrivs i detta protokoll. Ett kort förfarande för att tillverka den mikrofluidiska Chondrocyte-komprimeringsenheten visas i figur 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att testa effekterna av tryckhållfasthet på tillväxtplattan chondrocyter, utvecklade vi mikroflödessystem Chondrocyte komprimerings enhet (figur 1) för att tillämpa olika nivåer av tryckhållfasthet på chondrocyter i alginat hydrogel ställningen för 3D kultur i högt genomflöde sätt. För att hjälpa andra forskare att anta vår enhet eller utveckla liknande enheter, tillhandahöll vi Detaljer om enhetens tillverkningssteg i denna protokoll artikel.
<p class="jove_conten…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar DRS. Christopher Moraes och Stephen A. Morin för deras stöd för enheten design och tillverkning. Denna studie stöddes av bio Engineering för Human Health Grant från University of Nebraska-Lincoln (UNL) och University of Nebraska Medical Center (UNMC), och Grant AR070242 från NIH/NIAMS. Vi tackar Janice A. Taylor och James R. Talaska av den avancerade mikroskopi Core Facility vid University of Nebraska Medical Center för att ge hjälp med konfokalmikroskopi.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Air pump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | We used the model purchased in 2015. The internal design and performance of air pump (SP 500 EC-LC) changed in early 2016. Also, air pump performance has changed in the course of time. Thus, air pressure generated by an SP 500 EC-LC air pump should be calibrated before use. |
| Alginate powder | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Barb Straight Connectors (Metal tube) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Dyed red aqueous fluorescent particles | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Foam pad | GRAINGER | Item # 5GCE8 | |
| Function / Arbitrary Waveform Generator | Keysight Technologies | 33210A | |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher BioReagents | BP2633500 | |
| Isopropyl alcohol | BDH1174-4LP | VWR | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Power supply | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Solenoid valve | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Developer | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Sulfuric acid | EMD Millipore | MSX12445 |
Referências
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress. Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).
- Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays. BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).
- García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).
- Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression. BMC Biotechnology. 8 (1), 71 (2008).
- Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).
- Ménard, A. L., et al. In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate. Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).
- Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force. Bone. 29 (2), 105-113 (2001).
- Sergerie, K., et al. Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).
- Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation. Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).
- Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading. Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).
- Zimmermann, E. A., et al. In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression. Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).
- Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth. Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).
- Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits. Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).
- Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression. Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).
- Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression. Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).
- Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix. Bone. 44 (2), 306-315 (2009).
- Reich, A., et al. Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).
- Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading. Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).
- Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction. Bone. 41 (2), 197-205 (2007).
- Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions. Experimental Mechanics. , (2018).
- Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology. Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).
- Guilak, F. Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus. Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).
- Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression. Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture. Journal of Visualized Experiments. (46), e224 (2010).
- Sim, W. Y., et al. A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation. Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).
- Hosmane, S., et al. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).
- Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).
- Seo, J., et al. Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).
- Erickson, A. G., et al. A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds. Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
