Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica
Summary
Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.
Abstract
La metástasis transmitida por la sangre representa la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer e involucra células tumorales circulantes (CTCs) que tienen éxito en el establecimiento de nuevos tumores en sitios distantes. Los CTCs se encuentran en el torrente sanguíneo de los pacientes como células individuales (CTCs individuales) o como agregados multicelulares (clusters CTC y cúmulos de glóbulos blancos), con este último mostrando una mayor capacidad metastásica. Más allá de la enumeración, el análisis fenotírico y molecular es extraordinariamente importante para diseccionar la biología CTC y para identificar vulnerabilidades accionables. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de un flujo de trabajo que incluye inmunostinalización CTC y micromanipulación, cultura ex vivo para evaluar las capacidades proliferativas y de supervivencia de las células individuales, y los ensayos de formación de metástasis in vivo . Adicionalmente, proporcionamos un protocolo para lograr la disociación de los clústeres CTC en células individuales y la investigación de la heterogeneidad intra-cluster. Con estos enfoques, por ejemplo, cuantificamos con precisión la supervivencia y el potencial proliferativo de los CTCs únicos y las células individuales dentro de los clústeres CTC, lo que nos lleva a la observación de que las células dentro de los clústeres muestran una mejor supervivencia y proliferación en ex vivo en comparación con los únicos CTCS. en general, nuestro flujo de trabajo ofrece una plataforma para diseccionar las características de los CTCS a nivel de célula única, con el objetivo de identificar vías relevantes para la metástasis y una mejor comprensión de la biología CTC.
Introduction
La manifestación clínica de la metástasis en órganos distantes representa la etapa final de la progresión del cáncer y supone más del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer1. La transición de la enfermedad localizada a la metastásica es un proceso de varios pasos, a menudo mediado por células tumorales circulantes (CTCS)2,3,4. Estas células son derramadas del tumor primario en la circulación sanguínea y son transportadas a órganos distantes, donde pueden extravasar y establecer lesiones metastásicas5,6. Aunque los tumores sólidos pueden liberar un número relativamente alto de CTCs, la mayoría de los CTCs están destinados a morir, debido a las altas fuerzas de cizallamiento en circulación, la muerte celular mediada por anoikis, el ataque inmune o capacidades limitadas para adaptarse a un microambiente externo7. Por lo tanto, es fundamental establecer herramientas que permitan la disección de las características moleculares de los CTCs que están dotados de capacidad de propagación de metástasis. Estudios preclínicos y clínicos recientes sugieren que la presencia y la cantidad de los grupos de CTCS y CTC individuales se asocia con un resultado peor en pacientes con varios tipos de tumores sólidos8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . Los clusters CTC son grupos de dos o más CTCS Unidos entre sí durante la circulación y son más eficientes en la formación de metástasis en comparación con los únicos CTCS3,15,16. Las células dentro de un racimo mantienen una fuerte adherencia de las células celulares a través de los desmosomas y los cruces adherentes, lo que puede ayudar a vencer a los anoikis17,18. Recientemente, observamos que la agrupación de CTCs está ligada a la hipometilación de sitios de Unión para factores de transcripción asociados a la proliferación y a la proliferabilidad, lo que lleva a una mayor capacidad para iniciar con éxito la metástasis19. La disociación del clúster CTC da lugar a la remodelación de sitios clave de enlace y, en consecuencia, a la supresión de su potencial metastásico19. Adicionalmente a los grupos de células cancerosas, los CTCs también pueden asociarse a glóbulos blancos (con mayor frecuencia neutrófilos) para mantener altos niveles de proliferación en circulación y aumentar su capacidad metastásica20. Sin embargo, la biología de los CTCs se entiende sólo en parte y varias preguntas permanecen abiertas, incluyendo las características moleculares subyacentes y las vulnerabilidades de las células individuales y agrupadas.
En los últimos años, se han establecido varias estrategias que explotan los patrones de expresión de superficie celular, así como las propiedades físicas de los CTCs para su aislamiento21,22,23,24, 25. los métodos de aislamiento dependientes del antígeno dependen principalmente de la expresión de la superficie celular de la molécula de adhesión de células epiteliales (epcam)26. El más frecuentemente utilizado y (actualmente) la única plataforma aprobada por la FDA para la enumeración CTC, es el sistema CellSearch, que se basa en un procedimiento de dos pasos para aislar CTCs21. En el primer paso, los componentes de plasma se eliminan por centrifugación, mientras que los CTCs se capturan con ferrofluidos magnéticos acoplados a anticuerpos anti-EpCAM. En el segundo paso, la solución enriquecida con CTC se mancha para las células nucleadas (DAPI-positivas) que expresan citoqueratina (CK)8,18,19, mientras que los glóbulos blancos (WBCs) se identifican utilizando el marcador de panleucocitos CD45. Por último, las celdas capturadas se colocan en una plataforma de cribado integrada y los CTCs se identifican a través de la expresión de EpCAM, CKs y DAPI, mientras que son negativos para CD45. Aunque esto es considerado como el estándar de oro para la enumeración CTC, el análisis molecular descendente es desafiante con esta tecnología debido a las restricciones inherentes en la recuperación CTC. Adicionalmente, dado su procedimiento de aislamiento, CellSearch puede favorecer el enriquecimiento de CTCs con mayores niveles de EpCAM en comparación con los CTCs con una expresión EpCAM menor, debido, por ejemplo, a la heterogeneidad del cáncer27 o a la regulación descendente de los marcadores epiteliales 28,29. Para superar estas limitaciones, han surgido tecnologías independientes del antígeno para el enriquecimiento de los CTCs. Por ejemplo, el CTC-iChip integra la separación hidrodinámica de las células nucleadas, incluidos los CTCs y los glóbulos blancos de los componentes sanguíneos restantes, seguidos de un agotamiento inmunomagnético de los glóbulos blancos etiquetados con anticuerpos, lo que permite la purificación de CTCs no etiquetados y viables en solución25. Además, el hecho de que la mayoría de los CTCS son ligeramente más grandes que los glóbulos rojos (RBCs) o WBCs condujo al desarrollo de tecnologías de enriquecimiento CTC basadas en el tamaño23,30 (por ejemplo, el sistema parsortix (ángulo)) que hace uso de un tecnología basada en microfluidos, que comprende un canal de estrechamiento a través del cassette de separación, que lleva a las células a una brecha terminal de 10, 8, 6,5 o 4,5 μm (diferentes tamaños están disponibles dependiendo del diámetro esperado de las células cancerosas de destino). La mayoría de las células sanguíneas pasan a través de la estrecha brecha, mientras que los CTCs quedan atrapados debido a su tamaño (pero también debido a su menor deformabilidad) y, por lo tanto, se retienen en el cassette. Revertir la dirección del flujo permite la liberación de los CTCs capturados, que están en un Estado viable y adecuados para el análisis descendente. Sin embargo, independientemente del protocolo elegido para el aislamiento de CTC, los procedimientos típicos de post-enriquecimiento todavía producen CTCs que se mezclan con un número relativamente pequeño de glóbulos rojos y glóbulos blancos, lo que hace que el análisis de los CTCs puros o masivos sean un desafío. Para abordar este problema, establecimos un flujo de trabajo que permite la manipulación CTC sin sesgo potencial introducido por los contaminantes de las células sanguíneas. La adición de inmunostato previo, con combinaciones de anticuerpos variables, distingue los CTCs de las células sanguíneas e incluso permite identificar subgrupos CTC con perfiles de expresión de marcadores de superficie distintos. Este procedimiento altamente personalizable puede combinarse más adelante con aplicaciones derivadas específicas.
Aquí, describimos un flujo de trabajo que comienza desde un producto enriquecido CTC (obtenido con cualquier tecnología de enriquecimiento CTC de elección) y combina varios enfoques para obtener información sobre la biología CTC en la resolución de una sola célula. En pocas palabras, nuestro flujo de trabajo permite la identificación de los CTCs únicos, los clústeres CTC y los clústeres CTC-WBC por inmunostenación en vivo, seguidos por la micromanipulación de una sola célula y el análisis descendente utilizando protocolos de cultivo ex vivo , célula única secuenciación, y los ensayos de metástasis in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La caracterización molecular de los CTCs tiene la promesa de mejorar nuestra comprensión del proceso metastásico y guiar el desarrollo de nuevas terapias contra la metástasis. Aquí proporcionamos una descripción detallada de los protocolos que permiten la micromanipulación CTC y el análisis descendente, incluyendo tanto ensayos funcionales basados en células simples, análisis de expresión génica y trasplante in vivo para potencial metastásico evaluación20.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los pacientes que donaron sangre para nuestro estudio, así como a todos los médicos involucrados y enfermeras de estudio. Agradecemos a Jens Eberhardt, Uwe Birke y la Dra. Katharina Uhlig de ALS Automated Lab Solutions GmbH por su apoyo continuo. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de aceto por sus comentarios y discusiones. La investigación en el laboratorio de aceto está respaldada por el Consejo Europeo de investigación, la Unión Europea, la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza, la liga suiza contra el cáncer, la Liga de cáncer de Basilea, los dos cantones de Basilea a través de la ETH Zürich, y la Universidad de Basilea.
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
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