Her præsenterer vi en integreret arbejdsgang for at identificere fænotypiske og molekylære funktioner, der karakteriserer cirkulerende tumorceller (Ctc’er). Vi kombinerer levende immun farvning og robot-micromanipulation af enkelt-og klynge-Ctc’er med enkelt celle-baserede teknikker til downstream analyse og vurdering af metastaser-såning evne.
Blodbårne metastaser tegner sig for de fleste kræftrelaterede dødsfald og involverer cirkulerende tumorceller (Ctc’er), der har succes med at etablere nye tumorer på fjerntliggende steder. Ctc’er findes i blodbanen af patienter som enkeltceller (enkelt Ctc’er) eller som flercellede aggregater (CTC-klynger og CTC-hvide blod celle klynger), hvor sidstnævnte udviser en højere metastatisk evne. Ud over optælling er fænotypiske og molekylære analyser overordentlig vigtig for at dissekere CTC-biologi og identificere handlingsrettede sårbarheder. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af en arbejdsgang, der omfatter CTC immunofarvning og micromanipulation, ex vivo kultur for at vurdere proliferativ og overlevelse kapaciteter af individuelle celler, og in vivo metastase-formation assays. Derudover leverer vi en protokol for at opnå afkobling af CTC-klynger i individuelle celler og undersøgelse af heterogenitet inden for klynger. Med disse tilgange, for eksempel, vi præcist kvantificere overlevelse og proliferativ potentiale af enkelt ctc’er og individuelle celler i CTC klynger, hvilket fører os til den observation, at celler i klynger viser bedre overlevelse og spredning i ex sammenlignet med enkelte ctc’er. samlet set tilbyder vores arbejdsgang en platform til at dissekere ctc’s karakteristika på det enkelt celleniveau, der sigter mod at identificere metastaser-relevante veje og en bedre forståelse af CTC-biologi.
Den kliniske manifestation af metastaser i fjerne organer repræsenterer den sidste fase af kræft progression og tegner sig for mere end 90% af kræftrelaterede dødsfald1. Overgangen fra lokaliseret til metastatisk sygdom er en multi-trins proces, ofte medieret af cirkulerende tumorceller (ctc’er)2,3,4. Disse celler er udgydt fra den primære tumor i blodcirkulationen og transporteres til fjerne organer, hvor de kan ekstravasere og etablere metastatiske læsioner5,6. Selv om solide tumorer kan frigive et relativt højt antal Ctc’er, er de fleste Ctc’er bestemt til at dø, på grund af høje forskydningskræfter i omløb, anoikis-medieret celledød, immun angreb eller begrænsede kapaciteter til at tilpasse sig et udenlandsk mikromiljø7. Derfor er det afgørende at etablere værktøjer, der muliggør dissektion af de molekylære træk ved de Ctc’er, der er udstyret med metastaser-såning evne. Nylige prækliniske og kliniske undersøgelser tyder på, at tilstedeværelsen og mængden af enkelt ctc’er og CTC-klynger er forbundet med et dårligere resultat hos patienter med forskellige typer af solide tumorer8,9,10 , 11 af , 12 ud af , 13 ud af , 14 ud af . CTC-klynger er grupper af to eller flere ctc’er, der er knyttet til hinanden under cirkulation og er mere effektive i dannelsen af metastaser sammenlignet med enkelt ctcs3,15,16. Celler i en klynge opretholder stærk celle-celle vedhæftning gennem desmosomer og klæber vejkryds, som kan bidrage til at overvinde anoikis17,18. For nylig bemærkede vi, at klyngedannelse af Ctc’er er knyttet til hypomethylering af bindingssteder for stemthed-og proliferation-associerede transkription faktorer, hvilket fører til en øget evne til at initiere metastase19. CTC klynge afkobling resulterer i remodeling af centrale bindingssteder, og dermed undertrykkelse af deres metastatisk potentiale19. Desuden til klynger af kræftceller, Ctc’er kan også associere til hvide blodlegemer (hyppigst neutrofiler) at opretholde høje proliferation niveauer i omløb og øge deres metastatisk kapacitet20. Imidlertid er CTCs ‘ biologi kun delvist forstået, og flere spørgsmål forbliver åbne, herunder de underliggende molekylære funktioner og sårbarheder i enkelt-og klynge celler.
I de seneste år er der blevet etableret flere strategier, som udnytter celleoverflade udtryks mønstre samt ctc’er ‘ fysiske egenskaber til deres isolation21,22,23,24, 25. antigen-afhængige isolations metoder stole mest på udtrykket af celleoverfladen epithelial celle vedhæftning molekyle (epcam)26. Den hyppigst anvendte og (i øjeblikket) den eneste FDA-godkendte platform for CTC-optælling, er CellSearch-systemet, som er baseret på en totrinsprocedure for at isolere CTCs21. I det første trin fjernes plasma komponenterne ved centrifugering, mens Ctc’er optages med magnetiske ferrovæsker, der er koblet til anti-EpCAM-antistoffer. I det andet trin er den CTC-berigede opløsning plettet for nukleerede (dapi-positive) celler, der udtrykker cytokeratin (CK)8,18,19, mens hvide blodlegemer (WBCs) identificeres ved hjælp af Pan-leukocyt markør CD45. Endelig er indfangede celler placeret på en integreret screening platform og Ctc’er identificeres gennem udtrykket af EpCAM, CKs, og DAPI samtidig være negativ for CD45. Selvom dette anses for at være guldstandarden for CTC-optælling, er downstream-Molekylær analyse udfordrende med denne teknologi på grund af iboende begrænsninger i CTC-hentning. Desuden, i betragtning af sin isolation procedure, cellsearch kan favorisere berigelse af ctc’er med højere epcam niveauer i forhold til ctc’er med lavere epcam udtryk, skyldes for eksempel kræft heterogenitet27 eller downregulation af epitel markører 28,29. For at overvinde disse begrænsninger er der opstået antigen-uafhængige teknologier til berigelse af Ctc’er. For eksempel integrerer CTC-iChip Hydrodynamisk adskillelse af nukleerede celler, herunder Ctc’er og Wbc’er fra de resterende blodkomponenter, efterfulgt af en immunomagnetisk nedbrydning af antistof-mærkede Wbc’er, der muliggør rensning af ukodede og levedygtige Ctc’er i opløsning25. Desuden har det forhold, at de fleste ctc’er er lidt større end røde blodlegemer (RBC’er) eller WBCs, ført til udvikling af størrelses baserede CTC-berignings teknologier23,30 (f. eks. parsortix-systemet (Angle)), som gør brug af en mikrofluidic-baseret teknologi, der omfatter en indsnævring kanal på tværs af separations kassetten, førende celler til en Terminal hul på enten 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (forskellige størrelser er tilgængelige afhængigt af den forventede diameter af Target cancerceller). De fleste af blodcellerne passerer gennem den smalle kløft, mens Ctc’er bliver fanget på grund af deres størrelse (men også på grund af deres lavere deformabilitet) og er derfor bevaret i kassetten. Revertering af strømningsretningen muliggør frigivelse af indfangede Ctc’er, som er i en levedygtig tilstand og egner sig til downstream-analyse. Uafhængigt af den valgte protokol til CTC-isolation giver typiske procedurer efter berigelse dog stadig Ctc’er, der blandes med et relativt lille antal RBC’er og Wbc’er, hvilket gør analysen af rene enkelt-eller bulk-Ctc’er udfordrende. For at løse dette problem, vi etableret en arbejdsproces, der tillader CTC manipulation uden potentiel bias introduceret af blodlegemer kontaminanter. Tilføjelsen af immun farvning på forhånd, med variable antistof kombinationer, adskiller Ctc’er fra blodlegemer og gør det endda muligt at identificere CTC-undergrupper med særskilte overflade-markør udtryks profiler. Denne meget tilpasselig procedure kan derefter yderligere kombineres med specifikke downstream applikationer.
Her beskriver vi en arbejdsproces, der starter fra et CTC-beriget produkt (opnået med en hvilken som helst CTC-berigelses teknologi) og kombinerer flere tilgange for at få indsigt i CTC-biologi ved enkelt celle opløsning. I en nøddeskal, vores workflow gør det muligt at identificere enkelt ctc’er, CTC klynger og CTC-WBC klynger ved levende immun farvning, efterfulgt af en enkelt celle micromanipulation og downstream analyse ved hjælp af ex vivo dyrkning protokoller, enkelt celle sekvensering og in vivo -metastase-assays.
Den molekylære karakterisering af Ctc’er holder løftet om at forbedre vores forståelse af den metastatiske proces og guide udviklingen af nye anti-metastaser behandlinger. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af de protokoller, der muliggør CTC micromanipulation og downstream analyse, herunder både enkelt celle-baserede funktionelle assays, genekspression analyse og in vivo transplantation for metastatisk potentiale vurdering20.
Blandt de mest kritiske t…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle patienter, der donerede blod til vores undersøgelse, samt alle involverede klinikere og studere sygeplejersker. Vi takker Jens Eberhardt, Uwe Birke og Dr. Katharina Uhlig fra ALS Automated Lab Solutions GmbH for kontinuerlig support. Vi takker alle medlemmer af Aceto Lab for feedback og diskussioner. Forskning i Aceto Lab støttes af det europæiske forskningsråd, den Europæiske Union, den schweiziske National Science Foundation, den schweiziske Cancer League, Basel Cancer League, de to kantoner i Basel gennem ETH Zürich, og universitetet i Basel.
Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
CellD software | ALS | version 3.0 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |