التحليل الجزئي للخلايا السرطانية المتداولة للتحليل الجزيئي المصب والتقييم المحتمل المنتشر
Summary
هنا ، نقدم سير عمل متكامل لتحديد السمات الظاهرية والجزيئية التي تميز الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs). نحن الجمع بين المناعية الحية والروبوتية الجزئية من CTCs واحده ومجمعه مع التقنيات القائمة علي خليه واحده للتحليل المصب وتقييم القدرة الانبثاث البذر.
Abstract
حسابات الانبثاث المنقولة بالدم لمعظم الوفاات المرتبطة بالسرطان وينطوي علي تعميم الخلايا السرطانية (CTCs) التي تنجح في إنشاء أورام جديده في مواقع بعيده. يتم العثور علي CTCs في مجري الدم من المرضي كخلايا واحده (CTCs واحد) أو كمجاميع متعددة الخلية (التجمعات CTC وخلايا الدم البيضاء CTC) ، مع الاخيره عرض قدره اعلي المنتشر. والي جانب التعداد ، فان التحليل الظاهري والجزيئي مهم للغاية لتشريح بيولوجيا لجنه مكافحه الإرهاب ولتحديد أوجه الضعف القابلة للتنفيذ. هنا ، ونحن نقدم وصفا مفصلا لسير العمل الذي يتضمن المناعية CTC والجزئيات ، والثقافة الحية السابقة لتقييم قدرات التكاثر والبقاء علي قيد الحياة من الخلايا الفردية ، وفي الجسم الحية الانبثاث-اختبارات تشكيل. الاضافه إلى ذلك ، نقدم بروتوكولا لتحقيق تفكك مجموعات لجنه مكافحه الإرهاب في الخلايا الفردية والتحقيق في التجانس داخل المجموعات. ومن خلال هذه النهج ، علي سبيل المثال ، نقوم بتحديد كميات البقاء والقدرة التكاثرية لوحدات التحويلات الاحاديه والخلايا الفردية داخل مجموعات لجنه مكافحه الإرهاب ، مما يؤدي بنا إلى ملاحظه ان الخلايا داخل التكتلات تعرض البقاء والانتشار بشكل أفضل في ex الثقافات المجرية مقارنه مع ctcs واحد. وعموما ، يوفر سير العمل لدينا منصة لتشريح خصائص CTCs علي مستوي الخلية الواحدة ، والتي تهدف إلى تحديد مسارات ذات الصلة الانبثاث وفهم أفضل لعلم الاحياء CTC.
Introduction
المظهر السريري من الانبثاث في الاجهزه البعيدة يمثل المرحلة النهائية من تطور السرطان وتمثل أكثر من 90 ٪ من الوفاات المرتبطة بالسرطان1. الانتقال من الموضعية إلى المرض المنتشر هو عمليه متعددة الخطوات ، وغالبا ما توسط من خلال تعميم الخلايا السرطانية (ctcs)2،3،4. يتم إلقاء هذه الخلايا من الورم الأساسي في الدورة الدموية ويتم نقلها إلى الأعضاء البعيدة ، حيث قد اكسترافاساتي وإنشاء آلافات المنتشرة5،6. علي الرغم من ان الأورام الصلبة يمكن ان تطلق عددا كبيرا نسبيا من CTCs ، فان معظم CTCs مقدر لها ان تموت ، وذلك بسبب قوي القص العالية في الدورة الدموية ، وموت الخلايا بوساطة الدهن ، والهجوم المناعي أو القدرات المحدودة للتكيف مع البيئة الخارجية7 ولذلك ، فانه من الاهميه بمكان لإنشاء الاداات التي تمكن من تشريح السمات الجزيئية لتلك CTCs التي هبت مع القدرة الانبثاث البذر. وتشير الدراسات السريرية والسريرية الاخيره إلى ان وجود وكميه من التكتلات ctcs واحد ومكافحه الإرهاب يرتبط بنتيجة اسوا في المرضي الذين يعانون من أنواع مختلفه من الأورام الصلبة8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . مجموعات CTC هي مجموعات من اثنين أو أكثر من ctcs تعلق علي بعضها البعض اثناء الدورة الدموية وأكثر كفاءه في تشكيل الانبثاث بالمقارنة مع ctcs واحده3،15،16. الخلايا داخل كتله الحفاظ علي التصاق خليه خليه قويه من خلال ديموسيميس والتقاطعات ملتصقة ، والتي قد تساعد علي التغلب علي anoikis17،18. في الاونه الاخيره ، لاحظنا ان تجميع CTCs يرتبط بنقص ميثيل المواقع الملزمة لعوامل النسخ المرتبطة بالتكاثر والانتشار ، مما يؤدي إلى زيادة القدرة علي البدء بنجاح الورم الخبيث19. نتائج التفكك العنقودية CTC في أعاده عرض مواقع الربط الرئيسية ، التالي ، وقمع المحتملة المنتشرة19. بالاضافه إلى مجموعات من الخلايا السرطانية ، CTCs يمكن ان تقترن أيضا إلى خلايا الدم البيضاء (العدلات في معظم الأحيان) للحفاظ علي مستويات الانتشار العالية في الدورة الدموية وزيادة قدرتها المنتشرة20. ومع ذلك ، لا يفهم بيولوجيا CTCs الا جزئيا وتبقي عده اسئله مفتوحة ، بما في ذلك السمات الجزيئية الاساسيه ونقاط الضعف في الخلايا المفردة والمجمعة.
في السنوات الاخيره ، تم وضع العديد من الاستراتيجيات التي تستغل أنماط التعبير علي سطح الخلية وكذلك الخواص الفيزيائية لهذه التحويلات لعزلها21، 22،23،24، 25. مستضد تعتمد أساليب العزل في الغالب علي التعبير عن سطح الخلية الظهاريه خليه التصاق جزيء (epcam)26. الأكثر استخداما و (في الوقت الحاضر) الوحيد الذي وافقت عليه هيئه الاغذيه والعقاقير لتعداد لجنه مكافحه الإرهاب ، هو نظام CellSearch ، والذي يستند إلى اجراء من خطوتين لعزل CTCs21. في الخطوة الاولي ، يتم أزاله مكونات البلازما بواسطة طرد ، في حين يتم التقاط CTCs مع السوائل الحديدية المغناطيسية إلى جانب الأجسام المضادة لمكافحه EpCAM. في الخطوة الثانية ، يتم تلطيخ المحلول المخصب من قبل لجنه مكافحه الإرهاب للخلايا الموجبة (dapi) التي تعبر عن الكيراتين الخلوي (CK)8،18،19، في حين يتم تحديد خلايا الدم البيضاء باستخدام عموم الكريات البيضاء علامة CD45. وأخيرا ، يتم وضع الخلايا الملتقطة علي منصة فحص متكاملة ويتم تحديد CTCs من خلال التعبير عن EpCAM و CKs و DAPI بينما تكون سالبه ل CD45. علي الرغم من ان هذا يعتبر معيار الذهب لتعداد لجنه مكافحه الإرهاب, التحليل الجزيئي المصب تحديا مع هذه التكنولوجيا بسبب القيود المتاصله في استعاده لجنه مكافحه الإرهاب. بالاضافه إلى ذلك ، نظرا لاجراء العزلة ، cellsearch قد صالح إثراء ctcs مع مستويات epcam اعلي مقارنه ctcs مع التعبير epcam اقل ، بسبب علي سبيل المثال إلى السرطان تغاير27 أو دوونريجوليشن من علامات الظهاريه 28و29. وللتغلب علي هذه القيود ، برزت تكنولوجيات مستقله لإثراء هذه التحويلات. فعلي سبيل المثال ، تدمج لجنه مكافحه الإرهاب الفصل الهيدروديناميكي للخلايا النواة ، بما في ذلك CTCs والكريات الكربون الجوفية من مكونات الدم المتبقية ، تليها نضوب المناعية المغناطيسية من الأجسام المضادة للأجسام الموسومة ، مما يسمح تنقيه CTCs غير الموسومة وقابله للحياة في الحل25. بالاضافه إلى ذلك ، حقيقة ان معظم ctcs هي أكبر قليلا من خلايا الدم الحمراء (rbcs) أو الكريات الحمر أدت إلى تطوير تكنولوجيات التخصيب علي أساس الحجم CTC23،30 (علي سبيل المثال ، نظام parsortix (زاوية)) الذي يجعل استخدام التكنولوجيا القائمة علي microfluidic ، والتي تتالف من قناه تضييق عبر كاسيت الفصل ، والخلايا الرائدة إلى فجوه طرفيه من اما 10 ، 8 ، 6.5 أو 4.5 μm (احجام مختلفه متاحه تبعا لقطر المتوقع من الخلايا السرطانية المستهدفة). معظم خلايا الدم تمر من خلال الفجوة الضيقة ، في حين الحصول علي المحاصرين CTCs بسبب حجمها (ولكن أيضا بسبب انخفاض الخلايا) ، التالي ، يتم الاحتفاظ بها في الكاسيت. العودة إلى اتجاه التدفق يتيح الإفراج عن CTCs الملتقطة ، والتي هي في حاله قابله للحياة ومناسبه للتحليل المصب. وبمعزل عن البروتوكول الذي تم اختياره لعزل لجنه مكافحه الإرهاب ، فان الإجراءات النموذجية لما بعد التخصيب لا تزال تسفر عن عمليات CTCs مختلطة مع عدد صغير نسبيا من RBCs و bcs ، مما يجعل تحليل CTCs النقية واحده أو السائبة صعبه. ولمعالجه هذه المسالة ، انشانا سير عمل يسمح بالتلاعب باللجنة دون تحيز محتمل أدخلته ملوثات خلايا الدم. أضافه المناعي مسبقا ، مع مجموعات الأجسام المضادة المتغيرة ، ويميز CTCs من خلايا الدم ، وحتى يسمح لتحديد المجموعات الفرعية CTC مع ملامح التعبير السطحية مميزه متميزة. هذا الاجراء قابل للتخصيص للغاية يمكن بعد ذلك الجمع بين التطبيقات النهائية المحددة.
هنا ، ونحن وصف سير العمل الذي يبدا من المنتجات المخصبة CTC (الحصول عليها مع اي تكنولوجيا التخصيب CTC من الاختيار) ويجمع بين العديد من النهج للحصول علي نظره ثاقبه في علم الاحياء CTC في دقه خليه واحده. وباختصار ، فان سير العمل لدينا يتيح تحديد ctcs واحده ، وتجمعات ctc ومجموعات ctc-مكافحه الحرائق عن طريق المناعة الحية ، تليها الجزئي خليه واحده والتحليل المصب باستخدام بروتوكولات السابقة المجرية زراعه ، خليه واحده التسلسل ، وفي اختبارات الانبثاث الجسم الحيوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
التوصيف الجزيئي لctcs يحمل الوعد بتحسين فهمنا للعملية المنتشرة وتوجيه تطوير العلاجات الجديدة المضادة للانبثاث. نقدم هنا وصفا مفصلا لتلك البروتوكولات التي تمكن من التحليل الجزئي للجنة مكافحه الإرهاب والتحاليل النهائية ، بما في ذلك الاختبارات الوظيفية أحاديه الخلية وتحليل التعبير الجيني ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع المرضي الذين تبرعوا بالدم للدراسة لدينا ، وكذلك جميع الأطباء المعنيين والممرضات الدراسة. نشكر ينس ايبرهارت ، أوى بيركه ، والدكتورة كاثارينا Uhlig من حلول المختبر الألى المحدودة GmbH للحصول علي الدعم المستمر. ونشكر جميع أعضاء مختبر اسيالي علي التعقيبات والمناقشات. ويدعم البحث في مختبر Aceto من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، والاتحاد الأوروبي ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم ، والرابطة السويسرية للسرطان ، ورابطه بازل للسرطان ، وكانتونين من بازل من خلال ETH زيورخ ، وجامعه بازل.
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
Referências
- Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Pesquisa do Câncer. 70 (14), 5649-5669 (2010).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
- Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
- Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
- Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
- Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
- Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
- Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
- Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
- Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
- Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Pesquisa do Câncer. 78 (4), 845-852 (2018).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
- Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment?. Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
- Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
- Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
- Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
