循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

Summary

在这里, 我们提出了一个综合的工作流程, 以确定表型和分子特征的循环肿瘤细胞 (Ctc)。我们将单个和聚集 Ctc 的活体免疫染色和机器人微操作与单细胞技术结合起来, 对转移种子能力进行下游分析和评估。

Abstract

血源转移是大多数癌症相关死亡的原因, 涉及循环肿瘤细胞 (Ctc), 这些细胞成功地在遥远的地点建立了新的肿瘤。Ctc 作为单细胞 (单 Ctc) 或多细胞聚集体 (CTC 簇和 ctc-白细胞簇) 存在于患者的血液中, 后者表现出较高的转移性。除了枚举, 表型和分子分析是非常重要的解剖 CTC 生物学和确定可操作的漏洞。在这里, 我们提供了一个工作流程的详细描述, 其中包括 CTC 免疫染色和微操作, 体外培养, 以评估单个细胞的增殖和生存能力, 以及体内转移形成检测。此外, 我们还提供了一个协议, 以实现 CTC 集群分离到单个细胞和研究集群内异质性。例如, 通过这些方法, 我们精确地量化了 CTC 星系团中单个 Ctc 和单个细胞的存活和增殖潜力, 从而使我们能够观察到, 星系团内的细胞在 ctc 星系团中表现出更好的生存和增殖能力. 与单个 Ctc 相比, 体内培养物. 总体而言, 我们的工作流程提供了一个平台, 可在单个细胞水平上剖析 Ctc 的特征, 旨在识别与转移相关的途径, 更好地了解 CTC 生物学。

Introduction

远处器官转移的临床表现是癌症进展的最后阶段, 占癌症相关死亡的90% 以上1.从局部疾病向转移性疾病的过渡是一个多步骤的过程, 通常由循环肿瘤细胞 (ctcs)^2,3,4介导。这些细胞从原发肿瘤流到血液循环中, 输送到遥远的器官, 在那里它们可能会发生外渗, 并形成转移性病变⁵,⁶。虽然实体肿瘤可以释放出相对较高数量的 Ctc, 但由于循环中的高剪切力、负罪素介导的细胞死亡、免疫攻击或适应外来微环境的能力有限^,大多数 Ctc 注定会死亡7。因此, 它是至关重要的, 建立工具, 使解剖分子特征的 Ctc 被赋予了转移种子能力。最近的临床前和临床研究表明, 单个 ctc 和 ctc 簇的存在和数量与不同类型的实体瘤患者^的更糟糕的结果 8^{, 9,10,11,12,13,14}.Ctc 簇是两个或两个以上的 ctc 组, 在循环过程中相互附着, 与单个 ctc^{3、15、16 相比}, 更有效地形成转移。集群内的细胞通过脱粒体和粘连处保持强大的细胞粘附, 这可能有助于克服 anoikis^17,18。最近, 我们观察到 Ctc 的聚类与干细胞结合位点和增殖相关转录因子的低甲基化有关, 从而提高^{了成功启动转移的}能力19。CTC 聚类分离导致了关键结合位点的重塑, 从而抑制了它们的转移潜力¹⁹。除了癌细胞簇外, Ctc 还可以与白细胞 (最常见的中性粒细胞) 联系, 以保持循环中的高增殖水平, 并增加其转移能力²⁰。然而, Ctc 的生物学只被理解在一定程度上, 几个问题仍然悬而未决, 包括潜在的分子特征和单个和聚集细胞的脆弱性。

近年来, 已经建立了几种策略, 利用细胞表面表达模式以及 ctc 的物理性质^{进行隔离 21,22,23, 24,25}. 抗原依赖性分离方法主要依靠细胞表面上皮细胞粘附分子 (epcam)^的表达26。最常用的 (目前) fda 批准的 CTC 枚举平台是 Cell查除系统, 该系统基于两个步骤的程序来隔离 Ctc²¹。第一步, 等离子体成分通过离心去除, 而 Ctc 被捕获与抗 epcam 抗体耦合。第二步, 对表达细胞角蛋白 (ck) 8、^18、19的有核 (dapi 阳性) 细胞对 ctc 富集溶液^进行染色^,同时使用泛白细胞标记 CD45。最后, 捕获的细胞被放置在一个集成的筛选平台上, Ctc 通过 EpCAM、Ck 和 DAPI 的表达进行识别, 同时对 CD45 呈阴性。虽然这被认为是 CTC 枚举的黄金标准, 但由于 CTC 检索中固有的限制, 这种技术的下游分子分析具有挑战性。此外, 鉴于其分离过程, Cell查寻可能会倾向于富集 Ctc 具有较高的 Epcam 水平相比 Ctc 具有较低的 Epcam 表达, 例如由于癌症异质性²⁷或降低上皮标记^{的调节28,29}。为了克服这些限制, 出现了与抗原无关的技术来丰富 Ctc。例如, ctc-ichip 将包括 Ctc 和 Wbc 在内的有核细胞与剩余血液成分的流体动力分离结合起来, 然后对带有抗体标记的 wbc 进行免疫磁耗尽, 从而能够在解决方案²⁵。此外, 由于大多数 ctc 比红血球 (rbc) 或 wbc 稍大, 因此开发了基于大小的四氯化碳浓缩技术²³、³⁰ (例如 parsortix 系统 (angle)), 该技术利用了基于微流体的技术, 包括通过分离盒的狭窄通道, 将细胞带到10、8、6.5 或4.5 微米的终端间隙 (根据目标癌细胞的预期直径提供不同的大小)。大多数血细胞通过狭窄的缝隙, 而 Ctc 被困由于他们的大小 (但也由于他们的变形性较低), 因此, 被保留在盒式磁带。通过反转流动方向, 可以释放捕获的 Ctc, 这些 ctc 处于可行状态, 适合下游分析。然而, 除了选择的 CTC 隔离协议外, 典型的浓缩后程序仍然产生 Ctc, 而 Ctc 与相对较少的 Rbc 和 Wbc 混合在一起, 这使得对纯单一或批量 Ctc 的分析具有挑战性。为了解决这个问题, 我们建立了一个工作流程, 允许 CTC 操作, 而不会产生血细胞污染物带来的潜在偏差。事先添加免疫染色, 与可变抗体组合, 区分 Ctc 和血细胞, 甚至可以识别 Ctc 亚群具有明显的表面标记表达的轮廓。然后, 可以将此高度可自定义的过程与特定的下游应用程序进一步结合。

在这里, 我们描述了一个工作流程, 它从 ctc 浓缩产品 (获得任何 CTC 浓缩技术的选择) 开始, 并结合了几种方法, 以便在单细胞分辨率下深入了解 CTC 生物学。简而言之, 我们的工作流程通过活体免疫染色功能识别单个 CTCs、CTC 簇和 CTC-WBC 簇, 然后使用体内培养协议、单细胞进行单细胞微操作和下游分析测序和体内转移检测。

Protocol

所有涉及患者血液样本的手术都是在参与者签署知情同意的情况下进行的。程序是根据 EKNZ BASEC 2016-00067 和 ek 21/10 协议进行的, 该议定书得到了道德和体制审查委员会 (瑞士西北/欧洲伦理委员会 [EKNZ]) 的批准, 并符合《赫尔辛基宣言》。 所有有关动物的程序都是按照机构和州准则 (经批准的老鼠议定书 #2781, 巴塞尔市州兽医办公室) 进行的。 1. 患者样品制备<…

Representative Results

所提供的工作流程允许从单个 Ctc 或从 CTC 集群中分离出单个 Ctc 进行准备。患者或荷瘤小鼠的 Ctc 通过可用的 ctc 浓缩方法从全血中浓缩, 然后对癌症相关标记 (如 EpCAM、green) 和 wbc 特异性标记 (如 Cd45、红色) 进行抗体染色 (图 1 a)).然后将染色的 CTC 产品转移到微操作站, 如果提取单个细胞, 沉积在 PCR 管或多井板中, 并准备进行下游分析, 包括单细胞测?…

Discussion

Ctc 的分子表征有望提高我们对转移过程的认识, 并指导新的抗转移疗法的发展。在这里, 我们提供了这些协议的详细描述, 使 CTC 微操作和下游分析, 包括单细胞功能分析, 基因表达分析和体内移植转移潜力评估²⁰。

在我们协议中最关键的步骤中, 微操作 ctc 丰富的产品旨在从相对异质的细胞悬浮液中获得单个细胞分辨率, 即允许达到最高的纯度水平并提?…

Materials

Anti-human EpCAM-AF488	Cell Signaling Technology	CST5198	clone: VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate	Corning	3471
Anti-human CD45-BV605	Biolegend	304041	clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC	GeneTex	GTX11400	clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488	Biolegend	324410	clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605	Biolegend	103139	clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	for human blood collection
Cell Celector	ALS	CC1001	core unit
CellD software	ALS		version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA	Sarstedt	41.3395.005	for mouse blood collection
PCR tubes	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor	Thermo Fisher	AM2696	1 U/µL