מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית
Summary
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.
Abstract
דם גרורות המועברות חשבונות עבור מקרי מוות הקשורים לסרטן, כרוך במחזור תאים סרטניים (CTCs) כי הם מצליחים בהקמת גידולים חדשים באתרים מרוחקים. CTCs נמצאים במחזור הדם של חולים כמו תאים בודדים (CTCs יחיד) או כאגרגטים רב-תאיים (אשכולות CTC ו CTC-לבן האשכולות תא דם), עם האחרון המציג יכולת גרורתית גבוה יותר. מעבר לספירה, ניתוח פנומיטיות ומולקולרי הוא חשוב במיוחד כדי לנתח את ביולוגיה של CTC ולזהות פגיעויות שניתן לשאת. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של זרימת עבודה הכוללת CTC כתמים ומיקרומניפולציה, התרבות הvivo ex כדי להעריך את יכולות ההתרבות וההישרדות של תאים בודדים, ו ב vivo גרורות-היווצרות assays. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול להשגת הדיסוציאציה של אשכולות CTC לתאים בודדים וחקירה של טרוגניות באשכול. עם גישות אלה, למשל, אנחנו בדיוק לכמת הישרדות ופוטנציאל מתרבים של CTCs יחיד תאים בודדים בתוך אשכולות CTC, מוביל אותנו התבוננות כי תאים בתוך אשכולות להציג הישרדות טוב יותר התפשטות לשעבר תרבויות vivo לעומת CTCs יחיד. בסך הכל, זרימת העבודה שלנו מציעה פלטפורמה כדי לנתח את המאפיינים של CTCs ברמת התא בודד, במטרה לקראת זיהוי של מסלולים הרלוונטיים גרורות והבנה טובה יותר של CTC ביולוגיה.
Introduction
ביטוי קליני של גרורות באיברים רחוקים מייצג את השלב הסופי של התקדמות הסרטן וחשבונות עבור יותר מ 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן1. המעבר מתוך מחלה מקומית למחלה גרורתית הוא תהליך רב שלב, לעתים קרובות מתווכת על ידי במחזור תאים סרטניים (ctcs)2,3,4. תאים אלה הם לשפוך מן הגידול העיקרי לתוך זרימת הדם מועברים לאיברים מרוחקים, שם הם יכולים extravasate ולהקים נגעים גרורתית5,6. למרות גידולים מוצקים יכולים לשחרר מספר גבוה יחסית של CTCs, רוב CTCs נועדו למות, בשל כוחות להטות גבוה במחזור, anoikis-בתיווך מוות תאים, התקפה חיסונית או יכולות מוגבלות כדי להסתגל מיקרוסביבה זרה7. לכן, זה מרכזי להקים כלים המאפשרים את הניתוח של התכונות המולקולריות של אלה CTCs כי הם מצוידים ביכולת זריעת גרורות. מחקרים האחרונים פרה וקליניים מראים כי הנוכחות והכמות של ctcs יחיד ואשכולות CTC קשורה לתוצאה גרועה יותר בחולים עם סוגים שונים של גידולים מוצקים8,9,10 , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 . אשכולות CTC הם קבוצות של שניים או יותר ctcs מחוברים זה לזה במהלך המחזור ויעילים יותר ביצירת גרורות לעומת ctcs אחד3,15,16. תאים בתוך אשכול שומרים על הדבקה חזקה תא תא באמצעות הצמתים desmosomes וחסיד, אשר עשוי לסייע להתגבר על אנואיקיס17,18. לאחרונה, הבחנו כי התקבצות של CTCs מקושרת לhypאומולציה של אתרי הכריכה של שולי-והפצת שעתוק הקשורים, המובילה ליכולת מוגברת ליזום בהצלחה את גרורות19. CTC הדיסוציאציה גורמת לשיפוצים של אתרי האיגוד המרכזיים, וכתוצאה מכך, הדיכוי של הפוטנציאל הגרורתי שלהם19. בנוסף אשכולות של תאים סרטניים, CTCs יכול גם לשייך לתא הדם הלבן (לעתים קרובות נויטרופילים) כדי לשמור על רמות התפשטות גבוהות במחזור ולהגדיל יכולת גרורתית שלהם20. עם זאת, הביולוגיה של CTCs מובנת רק בחלק ומספר שאלות נשארות פתוחות, כולל התכונות המולקולריות והפגיעויות של תאים בודדים ומקובצים באשכולות.
בשנים האחרונות הוקמו מספר אסטרטגיות שינצלו את דפוסי הביטוי של משטח התא, כמו גם תכונות פיזיות של ctcs לבידוד שלהם21,22,23,24, 25. אנטיגן-שיטות בידוד תלוי להסתמך בעיקר על הביטוי של משטח התא אפיתל מולקולה הדבקה של תא (epcam)26. השימוש התכוף ביותר (בזמן הנוכחי) הפלטפורמה היחידה של ה-FDA עבור ספירה CTC, היא מערכת CellSearch, אשר מבוססת על הליך שני שלבים כדי לבודד CTCs21. בשלב הראשון, רכיבי פלזמה מוסרים על ידי צנטריפוגה, בעוד CTCs נלכדים עם מגנטי מגנטיים מצמידים אנטי EpCAM נוגדנים. בשלב השני, הפתרון CTC-מועשר מוכתם עבור נוקלאובטים (dapi-חיוביים) תאים המבטא ציטוקרטין (CK)8,18,19, בעוד תאי דם לבנים (wbcs) מזוהים באמצעות ה סמן CD45. לבסוף, תאים שנתפסו ממוקמים על פלטפורמת הקרנה משולבת CTCs מזוהים באמצעות הביטוי של EpCAM, אקס, ו DAPI תוך שלילי עבור CD45. למרות שהדבר נחשב לסטנדרט הזהב לספירת CTC, ניתוח מולקולרי במורד הזרם מאתגר עם טכנולוגיה זו בשל האילוצים הטבועים באחזור CTC. בנוסף, בהינתן הליך הבידוד שלה, CellSearch עשוי להעדיף את העשרת CTCs עם רמות EpCAM גבוהות יותר לעומת CTCs עם ביטוי התחתון EpCAM, בשל למשל סרטן טרוגניות27 או downregulation של סמנים אפיתל 28,29. כדי להתגבר על מגבלות אלה, טכנולוגיות בלתי תלויות אנטיגן להעשרה של CTCs הופיעו. לדוגמה, CTC-ichip משלבת הפרדה הידרודינמית של תאים נוקלאוטיים, כולל ctcs ו-wbcs מרכיבי הדם הנותרים, ולאחריו דלדול אימונוגנטית של נוגדן מתויג wbcs, המאפשר טיהור של ctcs מתויגים וקיימא ב פתרון25. בנוסף, העובדה כי רוב ctcs הם קצת יותר גדול מאשר כדוריות הדם האדומות (rbcs) או wbcs הובילו לפיתוח של טכנולוגיות העשרה מבוססות CTC גודל23,30 (למשל, מערכת parsortix (זווית)) אשר עושה שימוש ב מבוססי מיקרופלואידיג טכנולוגיה, הכוללת ערוץ היצרות על פני קלטת ההפרדה, תאים מובילים לפער מסוף של 10, 8, 6.5 או 4.5 יקרומטר (גדלים שונים זמינים בהתאם לקוטר צפוי של תאים סרטניים היעד). רוב תאי הדם עוברים דרך הפער הצר, בעוד CTCs לכודים בשל גודלם (אבל גם בשל deformability התחתון שלהם) והם, לכן, נשמרים בקלטת. החזרת כיוון הזרימה מאפשרת שחרורו של CTCs שנתפסו, אשר נמצאים במצב בר קיימא ומתאים לניתוח במורד הזרם. באופן עצמאי של הפרוטוקול הנבחר עבור בידוד CTC, עם זאת, הליכים שלאחר העשרה טיפוסי עדיין להניב CTCs כי הם מעורבים עם מספר קטן יחסית של RBCs ו-WBCs, ביצוע ניתוח של CTCs טהור או בצובר מאתגרת. כדי לטפל בבעיה זו, הקמנו זרימת עבודה המאפשרת תפעול CTC ללא הטיה פוטנציאלית שהוצגה על-ידי מזהמים של תאי דם. תוספת של כתמים חיסוניים מראש, עם שילובים משתנה נוגדן, מבדיל CTCs מתאי הדם ואף מאפשר לזהות תת קבוצות CTC עם פרופילים ביטוי משטח-סמן ברורים. זה הליך להתאמה אישית מאוד יכול להיות בשילוב נוסף עם יישומים ספציפיים במורד הזרם.
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה המתחילה ממוצר CTC-מועשר (שהושג עם כל טכנולוגיית CTC העשרה של בחירה) ומשלבת מספר גישות כדי לקבל תובנה לביולוגיה של CTC ברזולוציה של תא בודד. בקיצור, זרימת העבודה שלנו מאפשרת זיהוי של CTCs יחיד, אשכולות CTC ו CTC-WBC אשכולות על ידי החיסונית לחיות, ואחריו מיקרומניפולציה תא יחיד וניתוח במורד באמצעות פרוטוקולי vivo culturing לשעבר, תא בודד רצף, ו ב vivo גרורות.
Protocol
Representative Results
Discussion
האפיון המולקולרי של CTCs מחזיק בהבטחה לשפר את הבנתנו את התהליך הגרורתי ולהדריך את התפתחות הטיפולים החדשים נגד גרורות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הפרוטוקולים הללו המאפשרים CTC מיקרומניפולציה וניתוח במורד הזרם, כולל שניהם תא יחיד המבוסס על מבוססי תאים, ניתוח ביטוי גנים בהשתלה vivo עבור פ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל המטופלים שתרמו דם עבור המחקר שלנו, כמו גם כל קלינאים מעורבים ואחיות לימוד. אנו מודים לינס אברדט, בירק, ו ד ר קאטארינה Uhlig מ-ALS פתרונות מעבדה אוטומטיות GmbH לתמיכה רציפה. אנו מודים לכל חברי מעבדת Aceto למשוב ולדיונים. מחקר במעבדה Aceto נתמך על ידי מועצת המחקר האירופי, האיחוד האירופי, המדע הלאומי למדעים הלאומית, הסרטן השוויצרי ליג, באזל סרטן הליגה, שני הקנטונים של בזל דרך ETH ציריך, ואוניברסיטת בזל.
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
Referências
- Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Pesquisa do Câncer. 70 (14), 5649-5669 (2010).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
- Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
- Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
- Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
- Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
- Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
- Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
- Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
- Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
- Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Pesquisa do Câncer. 78 (4), 845-852 (2018).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
- Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment?. Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
- Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
- Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
- Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
