Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Summary

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Abstract

As metástases transmitidas pelo sangue representam a maioria das mortes relacionadas ao câncer e envolvem células tumorais circulantes (CTCs) que são bem-sucedidas no estabelecimento de novos tumores em locais distantes. Os CTCs são encontrados na corrente sanguínea de pacientes como células únicas (CTCs simples) ou como agregados multicelulares (clusters CTC e clusters de células sanguíneas CTC-brancas), com este último exibindo uma maior capacidade metastática. Além da enumeração, a análise fenotípica e molecular é extraordinariamente importante para dissecar a biologia de CTC e para identificar vulnerabilidades acionáveis. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um fluxo de trabalho que inclui imunocoloração e micromanipulação de CTC, cultura ex vivo para avaliar as capacidades proliferativas e de sobrevivência de células individuais e ensaios in vivo de formação de metástases. Adicionalmente, nós fornecemos um protocolo para conseguir a dissociação de clusters de CTC em pilhas individuais e a investigação da heterogeneidade do intra-conjunto. Com essas abordagens, por exemplo, quantificamos com precisão a sobrevida e o potencial proliferativo de CTCs individuais e células específicas dentro dos clusters de CTC, levando-nos à observação de que células dentro de clusters exibem melhor sobrevida e proliferação em ex em comparação com CTCs individuais. em geral, nosso fluxo de trabalho oferece uma plataforma para dissecar as características dos CTCs no nível de célula única, visando a identificação de vias relevantes para metástases e uma melhor compreensão da biologia da CTC.

Introduction

A manifestação clínica da metástase em órgãos distantes representa o estágio final da progressão do câncer e responde por mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer¹. A transição da doença localizada para a metastática é um processo de múltiplas etapas, muitas vezes mediada por células tumorais circulantes (CTCs)^2,3,4. Estas células são derramadas do tumor primário na circulação sanguínea e são transportadas para órgãos distantes, onde podem extravasar e estabelecer Lesões metastáticas^5,6. Embora os tumores sólidos possam liberar um número relativamente elevado de CTCs, a maioria dos CTCs estão destinados a morrer, devido às altas forças de cisalhamento em circulação, morte celular mediada por anoikis, ataque imunológico ou capacidades limitadas para se adaptar a um microambiente estrangeiro⁷. Portanto, é fundamental estabelecer ferramentas que permitam a dissecção das características moleculares desses CTCs que são dotados de capacidade de propagação de metástases. Estudos pré-clínicos e clínicos recentes sugerem que a presença e a quantidade de CTCs individuais e de clusters de CTC está associada a um pior desfecho em pacientes com vários tipos de tumores sólidos^{8,9,10 , 11} anos de ^{, 12 anos} de ^{, 13 anos} de ^{, 14 anos} de . Os clusters CTC são grupos de dois ou mais CTCs conectados entre si durante a circulação e são mais eficientes na formação de metástases em comparação com CTCs simples^3,15,16. Células dentro de um cluster mantêm forte adesão de células celulares através de desmossomas e junções aderências, o que pode ajudar a superar anoikis^17,18. Recentemente, observou-se que o agrupamento de CTCs está vinculado à hipometilação de sítios de ligação para fatores de transcrição associados à stemness e proliferação, levando a uma maior capacidade de iniciar com sucesso a metástase¹⁹. A dissociação do agrupamento CTC resulta na remodelação de sítios de ligação chave e, consequentemente, na supressão do seu potencial metastático¹⁹. Adicionalmente aos conjuntos de células cancerosas, os CTCs podem igualmente associar ao glóbulo branco (o mais freqüentemente neutrophils) para manter níveis elevados da proliferação na circulação e para aumentar sua capacidade metastática²⁰. No entanto, a biologia dos CTCs é entendida apenas em parte e várias questões permanecem abertas, incluindo as características moleculares subjacentes e vulnerabilidades de células simples e agrupadas.

Nos últimos anos, foram estabelecidas várias estratégias que exploram padrões de expressão celular-superfície, bem como propriedades físicas de CTCs para seu isolamento^21,22,²³,^{24, 25}. Antigen-os métodos dependentes da isolação dependem na maior parte da expressão da molécula da adesão da pilha epithelial da superfície da pilha (epcam)²⁶. O mais freqüentemente usado e (atualmente) a única plataforma aprovada pela FDA para a enumeração CTC, é o sistema CellSearch, que é baseado em um procedimento de duas etapas para isolar CTCs²¹. Na primeira etapa, os componentes do plasma são removidos por centrifugação, enquanto CTCs são capturados com Ferrofluidos magnéticos acoplados a anticorpos anti-EpCAM. Na segunda etapa, a solução enriquecida com CTC é manchada para células nucleadas (DAPI-positivas) expressando citoqueratina (CK)^8,18,¹⁹, enquanto os glóbulos brancos (WBCs) são identificados usando o marcador de leucocitário CD45. Finalmente, as pilhas capturadas são coloc em uma plataforma de seleção integrada e os CTCs são identificados com a expressão de EpCAM, CKs, e DAPI ao ser negativo para CD45. Embora este seja considerado o padrão ouro para a enumeração de CTC, a análise molecular a jusante é desafiante com esta tecnologia devido às limitações inerentes na recuperação do CTC. Além disso, dado o seu procedimento de isolamento, CellSearch pode favorecer o enriquecimento de CTCs com níveis de EpCAM mais elevados em comparação com CTCs com menor expressão EpCAM, devido, por exemplo, a heterogeneidade do cancro²⁷ ou downregulation de marcadores ^{epiteliais 28,29}. Para superar essas limitações, surgiram tecnologias independentes do antígeno para o enriquecimento de CTCs. Por exemplo, o CTC-ichip integra a separação hidrodinâmico de pilhas nucleadas, incluindo CTCs e WBCs dos componentes restantes do sangue, seguidos por um esgotamento imunomagnética de WBCs anticorpo-etiquetados, permitindo a purificação de CTCs untagged e viáveis em solução²⁵. Adicionalmente, o fato de que a maioria dos CTCs são ligeiramente maiores do que os glóbulos vermelhos (RBCs) ou WBCs levou ao desenvolvimento de tecnologias de enriquecimento de CTC baseadas em tamanho^23,30 (por exemplo, o sistema parsortix (Angle)) que faz uso de um tecnologia microfluídico-baseada, compreendendo um canal de estreitamento através da gaveta da separação, conduzindo as pilhas a uma abertura terminal de 10, 8, 6,5 ou 4,5 μm (os tamanhos diferentes estão disponíveis dependendo do diâmetro esperado de pilhas de cancro do alvo). A maioria das células sanguíneas passam pela lacuna estreita, enquanto CTCs ficar preso devido ao seu tamanho (mas também devido à sua baixa deformabilidade) e são, portanto, retidos na gaveta. Revertendo a direção do fluxo permite a liberação de CTCs capturados, que estão em um estado viável e adequado para análise downstream. Independentemente do protocolo escolhido para o isolamento de CTC, no entanto, os procedimentos típicos de pós-enriquecimento ainda produzem CTCs que são misturados com um número relativamente pequeno de RBCs e WBCs, fazendo a análise de CTCs puros ou em massa simples desafiador. Para abordar esta questão, estabelecemos um fluxo de trabalho que permite a manipulação de CTC sem potencial viés introduzido por contaminantes de células sanguíneas. A adição de imunocoloração de antemão, com combinações de anticorpos variáveis, distingue CTCs das células sanguíneas e até permite identificar subgrupos de CTC com perfis distintos de expressão de marcadores de superfície. Este procedimento altamente personalizável pode ser posteriormente combinado com aplicações específicas a jusante.

Aqui, nós descrevemos um fluxo de trabalho que comece de um produto CTC-enriquecido (obtido com toda a tecnologia do enriquecimento do CTC da escolha) e combine diversas aproximações para ganhar a introspecção na biologia do CTC na definição da único-pilha. Em poucas palavras, nosso fluxo de trabalho possibilita a identificação de CTCs simples, clusters CTC e clusters CTC-WBC por imunocoloração ao vivo, seguidos de micromanipulação de células simples e análise a jusante usando protocolos de cultivo ex vivo , uma única célula sequenciamento e ensaios in vivo de metástases.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo amostras de sangue dos pacientes foram realizados mediante consentimento informado assinado dos participantes. Os procedimentos foram executados de acordo com os protocolos EKNZ BASEC 2016-00067 e EK 321/10, aprovados pelo Conselho de ética e institucional de revisão (Comitê de éticas noroeste/central Suíça [EKNZ]), e em conformidade com a declaração de Helsínquia. Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados em conformidade com as di…

Representative Results

O fluxo de trabalho apresentado permite a preparação de CTCs individuais, seja de CTCs simples ou separados de clusters CTC. Os CTCs dos pacientes ou dos ratos tumor-tendo são enriquecidos do sangue inteiro com métodos disponíveis do CTC-enriquecimento e manchados então com os anticorpos de encontro aos marcadores Cancer-associados (por exemplo, EpCAM, verde) e marcadores WBC-específicos (por exemplo, CD45, vermelho) (Figura 1a ). O produto de CTC manc…

Discussion

A caracterização molecular dos CTCs tem a promessa de melhorar nossa compreensão do processo metastático e orientar o desenvolvimento de novas terapias antimetástases. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada daqueles protocolos que permitem a micromanipulação de CTC e a análise a jusante, incluindo ensaios funcionais de uma única pilha-baseada, análise da expressão de gene e in vivo transplantação para o potencial metastático avaliação²⁰.

<p class="jove_content"…

Materials

Anti-human EpCAM-AF488	Cell Signaling Technology	CST5198	clone: VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate	Corning	3471
Anti-human CD45-BV605	Biolegend	304041	clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC	GeneTex	GTX11400	clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488	Biolegend	324410	clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605	Biolegend	103139	clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	for human blood collection
Cell Celector	ALS	CC1001	core unit
CellD software	ALS		version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA	Sarstedt	41.3395.005	for mouse blood collection
PCR tubes	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor	Thermo Fisher	AM2696	1 U/µL