Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Cinzia Donato; Barbara  M. Szczerba; Manuel  C. Scheidmann; Francesc Castro-Giner; Nicola Aceto

doi:10.3791/59677

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Artigo de método

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

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DOI:

10.3791/59677

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14 de maio de 2019

Cinzia Donato^*¹ , Barbara M. Szczerba^*¹ , Manuel C. Scheidmann^*¹ , Francesc Castro-Giner¹^,² , Nicola Aceto¹

¹Cancer Metastasis Laboratory, Department of Biomedicine, University of Basel and University Hospital Basel, ²SIB Swiss Institute of Bioinformatics

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Resumo

As metástases transmitidas pelo sangue representam a maioria das mortes relacionadas ao câncer e envolvem células tumorais circulantes (CTCs) que são bem-sucedidas no estabelecimento de novos tumores em locais distantes. Os CTCs são encontrados na corrente sanguínea de pacientes como células únicas (CTCs simples) ou como agregados multicelulares (clusters CTC e clusters de células sanguíneas CTC-brancas), com este último exibindo uma maior capacidade metastática. Além da enumeração, a análise fenotípica e molecular é extraordinariamente importante para dissecar a biologia de CTC e para identificar vulnerabilidades acionáveis. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de um fluxo de trabalho que inclui imunocoloração e micromanipulação de CTC, cultura ex vivo para avaliar as capacidades proliferativas e de sobrevivência de células individuais e ensaios in vivo de formação de metástases. Adicionalmente, nós fornecemos um protocolo para conseguir a dissociação de clusters de CTC em pilhas individuais e a investigação da heterogeneidade do intra-conjunto. Com essas abordagens, por exemplo, quantificamos com precisão a sobrevida e o potencial proliferativo de CTCs individuais e células específicas dentro dos clusters de CTC, levando-nos à observação de que células dentro de clusters exibem melhor sobrevida e proliferação em ex em comparação com CTCs individuais. em geral, nosso fluxo de trabalho oferece uma plataforma para dissecar as características dos CTCs no nível de célula única, visando a identificação de vias relevantes para metástases e uma melhor compreensão da biologia da CTC.

Introdução

A manifestação clínica da metástase em órgãos distantes representa o estágio final da progressão do câncer e responde por mais de 90% das mortes relacionadas ao câncer¹. A transição da doença localizada para a metastática é um processo de múltiplas etapas, muitas vezes mediada por células tumorais circulantes (CTCs)²^,^3,4. Estas células são derramadas do tumor primário na circulação sanguínea e são transportadas para órgãos distantes, onde podem extravasar e estabelecer Lesões metastáticas^5,6....