نموذج الأوناوجراف ة الدم المحيطي البشري (PBMC) غير المشروع لأبحاث الأورام المناعية المترجمة (I-O)
Summary
نحن نصف خلية الدم الطرفية البشرية أحادية النووية (PBMC) – على أساس أنسنة نموذج الماوس xenograft لبحوث الأورام المناعية الترجمة. ويمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة مبدأ توجيهي عام لوضع نماذج مماثلة وتوصيفها لتقييم العلاج بالمعالجة I-O.
Abstract
اكتشاف وتطوير العلاج المناعي الأورام (I-O) في السنوات الأخيرة يمثل معلما في علاج السرطان. ومع ذلك، لا تزال تحديات العلاج قائمة. وتشكل النماذج الحيوانية القوية والمتصلة بالأمراض موارد حيوية لمواصلة البحث والتطوير قبل السريرية من أجل معالجة مجموعة من نقاط التفتيش المناعية الإضافية. هنا، نقوم بوصف خلية أحادية نوناأحادية للدم المحيطي البشري (PBMC) – نموذج xenograft ذو الطابع الإنساني. يستخدم BGB-A317 (Tislelizumab)، وهو جسم مضاد مضاد PD-1 في مرحلة متأخرة من التحقيق، كمثال لمناقشة إنشاء منصة، وتوصيف النموذج وتقييمات فعالية المخدرات. تدعم هذه الفئران الأنسنة نمو معظم الأورام البشرية التي تم اختبارها، مما يسمح بتقييم علاجات I-O في سياق كل من المناعة البشرية والسرطانات البشرية. وبمجرد إنشائها، يكون نموذجنا فعالاً من حيث الوقت والتكلفة نسبياً، وعادة ما يسفر عن نتائج قابلة للاستنساخ إلى حد كبير. نقترح أن البروتوكول المبين في هذه المادة يمكن أن تكون بمثابة مبدأ توجيهي عام لإنشاء نماذج الماوس المعاد تشكيلها مع PBMC الإنسان والأورام للبحوث I-O.
Introduction
الأورام المناعية (I-O) هو مجال سريع التوسع لعلاج السرطان. وقد بدأ الباحثون مؤخرا لتقدير الإمكانات العلاجية لتعديل وظائف الجهاز المناعي لمهاجمة الأورام. وقد أظهرت حواجز المناعة الحصار أنشطة مشجعة في مجموعة متنوعة من أنواع السرطان، بما فيذلك سرطان الجلد، سرطان الخلايا الكلوية، الرأس والرقبة، الرئة، المثانة وسرطان البروستاتا 1،2. على عكس العلاجات المستهدفة التي تقتل الخلايا السرطانية مباشرة، تقوي علاجات I-O الجهاز المناعي في الجسم لمهاجمة الأورام3.
وحتى الآن، تم وضع العديد من النماذج الحيوانية ذات الصلة I-O. وتشمل هذه: 1) خطوط الخلايا ورم الماوس أو homograft الورم في الفئران syngeneic; 2) الأورام العفوية المستمدة من الماوس المهندسة وراثيا (GEM) أو الحث المسرطن؛ 3) GEMs chimeric مع ضرب في هدف (أهداف) المخدرات البشرية في جهاز المناعة murine وظيفية؛ و4) الفئران مع المناعة البشرية المعاد تشكيلها المزروعة مع الخلايا السرطانية البشرية أو xenografts المستمدة من المريض (PDXs). كل من هذه النماذج لها مزايا واضحة، فضلا عن القيود، والتي تم وصفها واستعراضها على نطاق واسع في أماكن أخرى4.
إعادة تشكيل المناعة البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة قد تم تقديرها بشكل متزايد كنهج ذات الصلة سريريا للبحوث I-O الترجمة. وعادة ما يتحقق ذلك إما من خلال 1) تطعيم الخلايا المناعية للبالغين (على سبيل المثال، الخلايا أحادية النووية أحادية اللانووية في الدم المحيطي (PMBC))5أو6أو 2) تطعيم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) من، على سبيل المثال، دم الحبل السري أو الجنين الكبد7,8. هذه الفئران أنسنة يمكن أن تدعم نمو الأورام البشرية، مما يسمح بتقييم العلاجات I-O في سياق كل من المناعة البشرية والسرطانات البشرية. وعلى الرغم من المزايا، فإن تطبيقات الفئران الأنسنة في أبحاث I-O عادة ما تعوقها عدة شواغل، مثل وقت تطوير النموذج الطويل والتكلفة المرتفعة إلى حد كبير.
هنا، نقوم بوصف نموذج الإنسان القائم على PBMC التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لدراسات I-O الترجمة. هذا النموذج هو نسبيا الوقت وفعالة من حيث التكلفة مع استنساخ عالية في دراسات الفعالية. وقد تم استخدامه في المنزل لتقييم العديد من العلاجات I-O حاليا تحت التنمية قبل السريرية والسريرية. BGB-A317 (Tislelizumab)، وهوجسم مضاد مضاد PD-1 9، يستخدم كمثال لمناقشة تطوير النموذج، والتوصيف، والتطبيقات الممكنة لتحليل فعالية مكافحة الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تقدمت معرفتنا بتطور السرطان وتطوره بشكل كبير في السنوات الأخيرة، مع التركيز على فهم شامل لكل من الخلايا السرطانية وستروما المرتبطة بها. ويمكن أن يؤدي تسخير آليات المناعة المضيفة إلى إحداث أثر أكبر على الخلايا السرطانية، مما يمثل استراتيجية علاج واعدة. وقد استخدمت على نطاق واسع نماذج …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء مختبراتنا على المناقشات المفيدة. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث الابتكار والزراعة في مجال علوم الطب الحيوي والحياة التابع للجنة العلوم والتكنولوجيا لبلدية بكين بموجب اتفاق المنحرقم . Z151100003915070 (مشروع “دراسة ما قبل السريرية على رواية الأورام المناعية المضادة للورم المخدرات BGB-A317”)، وكان أيضا بدعم جزئي من قبل تمويل الشركة الداخلية للبحوث ما قبل السريرية.
Materials
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | — | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
Referências
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
