Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)
Summary
Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.
Abstract
A descoberta e desenvolvimento da terapia de imuno-Oncologia (I-O) nos últimos anos representa um marco no tratamento do câncer. No entanto, persistem desafios de tratamento. Modelos animais robustos e relevantes para a doença são recursos vitais para a continuação da investigação pré-clínica e do desenvolvimento, a fim de abordar uma série de pontos de verificação imunológicos adicionais. Aqui, nós descrevemos uma pilha mononucleares humana do sangue periférico (PBMC)-modelo humanizado baseado do xenograft. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional no desenvolvimento clínico em estágio tardio, é usado como exemplo para discutir a criação da plataforma, a caracterização do modelo e as avaliações da eficácia do fármaco. Estes ratos humanizados apoiam o crescimento da maioria dos tumores humanos testados, permitindo assim a avaliação de terapias de I-O no contexto da imunidade humana e dos cânceres humanos. Uma vez estabelecido, nosso modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz, e geralmente produzem resultados altamente reprodutíveis. Nós sugerimos que o protocolo esboçado neste artigo pudesse servir como uma diretriz geral para estabelecer os modelos do rato reconstituídos com O PBMC humano e os tumores para a pesquisa do I-O.
Introduction
A imuno-Oncologia (I-O) é um campo de tratamento de câncer em rápida expansão. Os pesquisadores começaram recentemente a apreciar o potencial terapêutico das funções moduladoras do sistema imunológico para atacar tumores. Bloqueios de ponto de verificação imunológico demonstraram atividades encorajadoras em uma variedade de tipos de câncer, incluindo melanoma, Carcinoma de células renais, cabeça e pescoço, pulmão, câncer de bexiga e próstata1,2. Ao contrário das terapias direcionadas que matam diretamente as células cancerosas, as terapias I-O potenciam o sistema imunológico do corpo para atacar os tumores3.
Até à data, foram estabelecidos numerosos modelos de animais de I-O relevantes. Estes incluem: 1) linhas de pilha do tumor do rato ou homoenxerto do tumor em ratos syngeneic; 2) tumores espontâneos derivados do rato geneticamente projetado (GEM) ou da indução carcinogênica; 3) gemas quiméricas com o knock-in de alvo de droga humana (s) em um sistema imunológico funcional murino; e 4) camundongos com imunidade humana reconstituída transplantados com células cancerosas humanas ou xenoenxertos derivados do paciente (PDXs). Cada um destes modelos têm vantagens óbvias, bem como limitações, que foram descritos e revistos extensivamente em outros lugares4.
A reconstituição da imunidade humana em camundongos imunodeficientes tem sido valorizada como uma abordagem clinicamente relevante para a pesquisa de I-O translacional. Isto é conseguido geralmente com o 1) Engraftment de pilhas imunes adultas (por exemplo, pilhas mononucleares do sangue periférico (pmbc))5,6, ou 2) Engraftment de pilhas de haste hematopoietic (HSC) de, por exemplo, sangue do cordão umbilical ou fetal fígado7,8. Estes ratos humanizados poderiam apoiar o crescimento de tumores humanos, permitindo assim a avaliação de terapias do I-O no contexto da imunidade humana e dos cancros humanos. Apesar das vantagens, as aplicações de camundongos humanizados na pesquisa I-O foram geralmente prejudicadas por diversas preocupações, como o tempo de desenvolvimento do modelo longo e o custo consideravelmente elevado.
Aqui, nós descrevemos um modelo PBMC-baseado humano que poderia extensamente ser aplicado para estudos translacional do I-O. Este modelo é comparativamente tempo-e custo-eficaz com reprodutibilidade elevada em estudos da eficácia. Tem sido utilizado em casa para as avaliações de várias terapêuticas I-O atualmente desenvolvimento pré-clínico e clínico. BGB-A317 (Tislelizumab), um anticorpo anti-PD-1 humanizado investigacional9 , é utilizado como exemplo para discutir o desenvolvimento do modelo, caracterização e possíveis aplicações para análises de eficácia antitumoral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso conhecimento do desenvolvimento e da progressão do cancro avançou significativamente nos últimos anos, com foco em uma compreensão detalhada das pilhas do tumor e de seu estroma associado. Aproveitar os mecanismos imunes do hospedeiro poderia induzir um maior impacto contra as células cancerosas, representando uma estratégia de tratamento promissora. Os modelos murinos com sistemas imunológicos de rato intacto, como os modelos syngeneic e GEM, têm sido amplamente utilizados para estudar a imunidade mediada …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros dos nossos laboratórios por discussões úteis. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo programa de pesquisa de inovação e cultivo biomédico e de Ciências da vida da Comissão Municipal de ciência e tecnologia de Pequim, o acordo de subvenção n º. Z151100003915070 (projeto “estudo pré-clínico sobre uma nova droga antitumoral de Oncologia imunológica BGB-A317”), e também foi parcialmente apoiado pelo financiamento interno da empresa para pesquisa pré-clínica.
Materials
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | — | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
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