Çevirisel İmmüno-onkoloji (I-O) Araştırma için İnsani Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Modeli
Summary
Biz bir insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) – çeviriimmün-onkoloji araştırma için insanlaşmış ksenogreft fare modeli dayalı açıklar. Bu protokol, I-O terapi değerlendirmesi için benzer modellerin oluşturulması ve karakterizasyonu için genel bir kılavuz görevi görebılabilir.
Abstract
Son yıllarda immüno-onkoloji (I-O) tedavisinin keşfi ve geliştirilmesi kanser tedavisinde bir kilometre taşını temsil ediyor. Ancak, tedavi zorlukları devam etmektedir. Sağlam ve hastalıkla ilgili hayvan modelleri, bir dizi ek bağışıklık kontrol noktasını ele almak için klinik öncesi araştırma ve geliştirmenin sürdürülmesi için hayati kaynaklardır. Burada insan periferik kan mononükleer hücre (PBMC) – insanlaşmış ksenogreft modeli tabanlı açıklar. BGB-A317 (Tislelizumab), geç evre klinik gelişimde insanlaşmış bir anti-PD-1 antikor, platform kurulumu, model karakterizasyonu ve ilaç etkinliği değerlendirmelerini tartışmak için örnek olarak kullanılır. Bu insanlaşmış fareler test edilen çoğu insan tümörü büyümesini destekleyerek, i-O terapilerinin hem insan bağışıklığı hem de insan kanserleri bağlamında değerlendirilmesini sağlar. Kurulduktan sonra, bizim model nispeten zaman ve maliyet-etkin, ve genellikle son derece tekrarlanabilir sonuçlar verim. Bu makalede özetlenen protokolün, insan PBMC ve I-O araştırmaları için tümörlerle yeniden oluşturulmuş fare modellerinin oluşturulmasıiçin genel bir kılavuz görevi görebildiğini önermekteyiz.
Introduction
İmmüno-onkoloji (I-O) hızla genişleyen bir kanser tedavisi alanıdır. Araştırmacılar son zamanlarda tümörlere saldırmak için bağışıklık sisteminin fonksiyonlarını modüle terapötik potansiyelini takdir etmeye başladı. Bağışıklık kontrol noktası blokajları melanom, böbrek hücreli karsinom, baş ve boyun, akciğer, mesane ve prostat kanserleri 1 dahil olmak üzere kanser türleri, çeşitli teşvik edici faaliyetleri göstermiştir1,2. Doğrudan kanser hücrelerini öldürmek hedefli tedavilerin aksine, I-O tedaviler tümörler3saldırmak için vücudun bağışıklık sistemini güçlendirmek .
Bugüne kadar, çok sayıda ilgili I-O hayvan modelleri kurulmuştur. Bunlar şunlardır: 1) singenekik farelerde fare tümör hücre hatları veya tümör homogreft; 2) genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) veya kanserojen indüksiyon elde edilen spontan tümörler; Fonksiyonel bir murine bağışıklık sisteminde insan ilaç hedef knock-in ile 3) şeymerik GEMs(ler); ve 4) insan kanser hücreleri veya hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) ile nakledilen insan bağışıklık yeniden oluşturulan fareler. Bu modellerin her biri açık avantajları yanı sıra sınırlamalar, hangi açıklanan ve kapsamlı başka bir yerde gözden geçirilmiştir4.
İmmün eksik farelerde insan bağışıklığının yeniden yapılandırılması, çevirici I-O araştırmaları için klinik olarak uygun bir yaklaşım olarak giderek daha fazla takdir edilmektedir. Bu genellikle ya yoluyla elde edilir 1) yetişkin bağışıklık hücrelerinin engraftment (örneğin, periferik kan mononükleer hücreler (PMBC))5,6, veya 2) hematopoetik kök hücrelerin ingraftment (HSC) gelen, örneğin, göbek kordon kanı veya fetal karaciğer7,8. Bu insanlaşmış fareler insan tümörlerinin büyümesini destekleyebilir, böylece hem insan bağışıklığı hem de insan kanserleri bağlamında I-O terapilerinin değerlendirilmesini sağlar. Avantajlarına rağmen, I-O araştırmainsanlaşmış farelerin uygulamaları genellikle uzun model geliştirme süresi ve önemli ölçüde yüksek maliyet gibi çeşitli endişeler tarafından engellendi.
Burada, yaygın çeviri I-O çalışmaları için uygulanabilir bir insan PBMC tabanlı modeli açıklar. Bu model, etkinlik çalışmalarında yüksek tekrarlanabilirlik ile nispeten zaman ve maliyet-etkindir. Şu anda preklinik ve klinik gelişim altında olan birçok I-O terapötiklerinin değerlendirilmesi için şirket içinde kullanılmaktadır. BGB-A317 (Tislelizumab), bir araştırma insanlaştırılmış anti-PD-1 antikor9, model gelişimi tartışmak için örnek olarak kullanılır, karakterizasyon, ve anti-tümör etkinliği analizleri için olası uygulamalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser gelişimi ve ilerlemesi hakkındaki bilgimiz son yıllarda hem tümör hücrelerinin hem de ilişkili stromanın kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına odaklanarak önemli ölçüde ilerlemiştir. Konak bağışıklık mekanizmaları harnessing kanser hücrelerine karşı daha büyük bir etkiye neden olabilir, umut verici bir tedavi stratejisi temsil eden. Singenik ve GEM modelleri gibi sağlam fare bağışıklık sistemlerine sahip murine modelleri, kontrol noktası aracılı bağışıklığı incelemek için…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yardımcı tartışmalar için laboratuvar üyelerimize teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Hibe Anlaşması No altında Pekin Belediye Bilim ve Teknoloji Komisyonu Biyomedikal ve Yaşam Bilimi Yenilik ve Yetiştirme Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Z15110003915070 (“Yeni bir immün onkoloji anti-tümör ilacı BGB-A317 üzerinde klinik öncesi çalışma” projesi) ve aynı zamanda kısmen klinik öncesi araştırmalar için dahili şirket finansmanı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| PBMC separation /cell culture | |||
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Cell isolation |
| DMEM | Corning | 10-013-CVR | Cell culture |
| DPBS | Corning | 21-031-CVR | Cell culture |
| FBS | Corning | 35-076-CV | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-163 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-114 | Cell culture |
| Matrigel | Corning | 356237 | CDX inoculation |
| FACS analysis | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25 | Sample preparation |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130 | Sample preparation |
| Anti-mouse/human CD11b (M1/70) antibody | BioLegend | 101206 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6C (HK1.4) antibody | BioLegend | 128008 | FACS |
| Anti-mouse Ly-6G (1A8) antibody | BioLegend | 127614 | FACS |
| Anti-human CD8 (OKT8) antibody | Sungene Biotech | H10082-11H | FACS |
| Anti-human CD279 (MIH4) antibody | eBioscience | 12-9969-42 | FACS |
| Anti-human CD3 (HIT3a) antibody | 4A Biotech | — | FACS |
| Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer | Millipore | 0500-4008 | FACS |
| Tumor/PDX implantation /dosing / measurement | |||
| Cyclophosphamide | J&K | Cat#419656, CAS#6055-19-2 | In vivo efficacy |
| Disulfiram | J&K | Cat#591123, CAS#97-77-8 | In vivo efficacy |
| Syringe | BD | 300841 | CDX inoculation |
| Hypodermic needles (14G) | Shanghai SA Mediciall & Plastic Instruments Co., Ltd. | 0.7*32 TW SB | PDX inoculation |
| Vernier Caliper (MarCal) | Mahr | 16ER | Tumor measurement |
| IVC individual ventilated cages | Lingyunboji Ltd. | IVC-128 | Animal facility |
| IHC | |||
| Leica ASP200 Vacuum tissue processor | Leica | ASP200 | IHC |
| Leica RM2235 Manual Rotary Microtome for Routine Sectioning | Leica | RM2235 | IHC |
| Leica EG1150 H Heated Paraffin Embedding Module | Leica | EG1150 H | IHC |
| Ariol-Clinical IHC and FISH Scanner | Leica | Ariol | IHC |
| Anti-human CD8 (EP334) antibody | ZSGB-Bio | ZA-0508 | IHC |
| Anti-human PD1 [NAT105] antibody | Abcam | ab52587 | IHC |
| Anti-human PD-L1 (E1L3N) antibody | Cell Signaling Technology | 13684S | IHC |
| Polink-2 plus Polymer HRP Detection System | ZSGB-Bio | PV-9001/9002 | IHC |
Referências
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. Journal of Clinical Oncology. 33 (17), 1974-1982 (2015).
- Li, Z., Kang, Y. Emerging therapeutic targets in metastatic progression: A focus on breast cancer. Pharmacology & Therapeutics. 161, 79-96 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Fisher, T. S., et al. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (10), 1721-1733 (2012).
- McCormack, E., et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (4), 773-785 (2013).
- Rongvaux, A., et al. Human hemato-lymphoid system mice: current use and future potential for medicine. Annual Review of Immunology. 31, 635-674 (2013).
- Matsumura, T., et al. Functional CD5+ B cells develop predominantly in the spleen of NOD/SCID/gammac(null) (NOG) mice transplanted either with human umbilical cord blood, bone marrow, or mobilized peripheral blood CD34+ cells. Experimental Hematology. 31 (9), 789-797 (2003).
- Zhang, T., et al. The binding of an anti-PD-1 antibody to FcgammaRIota has a profound impact on its biological functions. Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (7), 1079-1090 (2018).
- Gamelli, R. L., Ershler, W. B., Hacker, M. P., Foster, R. S. The effect of disulfiram on cyclophosphamide-mediated myeloid toxicity. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 16 (2), 153-155 (1986).
- Dunay, I. R., Fuchs, A., Sibley, L. D. Inflammatory monocytes but not neutrophils are necessary to control infection with Toxoplasma gondii in mice. Infection and Immunity. 78 (4), 1564-1570 (2010).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6808-6817 (2015).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Mahdi, B. M. A glow of HLA typing in organ transplantation. Clinical and Translational Medicine. 2 (1), 6 (2013).
- Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunolog. 12 (11), 786-798 (2012).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. Journal of Infectious Diseases. 208, 125-130 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunolog. 7 (2), 118-130 (2007).
- Brehm, M. A., et al. NOD-scid IL2rgnull (NSG) mice deficient in murine MHC Class I and Class II expression support engraftment of functional human T cells in the absence of acute xenogeneic GVHD following injection of PBMC. The Journal of Immunology. 200, 57 (2018).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Sasaki, E., et al. Development of a preclinical humanized mouse model to evaluate acute toxicity of an influenza vaccine. Oncotarget. 9 (40), 25751-25763 (2018).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
