Elektrofysiologiske undersøgelser af Retinogeniculate og Kortikogeniculate synapse funktion
Summary
Her præsenterer vi protokoller for fremstilling af akutte hjerne skiver, der indeholder den laterale geniculate kerne og den elektrofysiologiske undersøgelse af retinogeniculate og kortikogeniculate synapser funktion. Denne protokol giver en effektiv måde at studere synapser med den høje frigivelse og lav frigivelse sandsynlighed i de samme akutte hjerne skiver.
Abstract
Den laterale geniculate Nucleus er den første relæstation for den visuelle information. Relæ neuroner i denne thalamic Nucleus integrerer input fra retinal ganglion celler og Projicer det til den visuelle cortex. Derudover modtager relæ neuroner top-down excitation fra cortex. De to vigtigste excitatoriske input til relæ neuroner adskiller sig i flere aspekter. Hver relæ neuron modtager input fra kun nogle få retinogeniculate synapser, som er store terminaler med mange udgivelses steder. Dette afspejles af den sammenligneligt stærke excitation, relæ neuroner modtage, fra retinal ganglion celler. Kortikogeniculate synapser, i modsætning, er enklere med få frigivelse sites og svagere synaptisk styrke. De to synapser adskiller sig også i deres synaptiske kortsigtede plasticitet. Retinogeniculate synapser har en høj frigivelse sandsynlighed og dermed vise en kortvarig depression. I modsætning hertil har kortikogeniculate synapser en lav frigivelse sandsynlighed. Kortikogeniculate-fibre krydser de retikulære thalamic-kerner, før de går ind i den laterale geniculate-kerne. De forskellige placeringer af den retikulære thalamic-kerne (rostrally fra den laterale geniculate-kerne) og optisk kanal (ventro-sideværts fra den laterale geniculate-kerne) gør det muligt at stimulere kortikogeniculate eller retinogeniculate synapser separat med ekstracellulære stimulations elektroer. Dette gør den laterale geniculate Nucleus en ideel hjerne område, hvor to excitatoriske synapser med meget forskellige egenskaber, der påvirker den samme celletype, kan undersøgt samtidigt. Her beskriver vi en metode til at undersøge optagelsen fra relæ neuroner og til at udføre detaljeret analyse af retinogeniculate og kortikogeniculate synapse funktion i akutte hjerne skiver. Artiklen indeholder en trin-for-trin-protokol til generering af akutte hjerne skiver af den laterale geniculate Nucleus og trin til registrering af aktivitet fra relæ neuroner ved at stimulere optisk tarmkanalen og kortikogeniculate fibre separat.
Introduction
Relæ neuroner i lateral geniculate Nucleus integrerer og videreformidle visuelle oplysninger til den visuelle cortex. Disse neuroner modtager excitatoriske input fra ganglion celler via retinogeniculate synapser, som giver den vigtigste excitatoriske drev for relæ neuroner. Derudover modtager relæ neuroner excitatoriske input fra kortikale neuroner via kortikogeniculate synapser. Desuden modtager relæ neuroner hæmmende input fra lokale interneuroner og gabaerge neuroner i Nucleus reticularis og1. Kernen reticularis og er til stede som et skjold mellem thalamus og cortex sådan, at fibre projicerer fra cortex til thalamus og i den modsatte retning skal gå gennem Nucleus reticularis og2.
Retinogeniculate indgange og kortikogeniculate indgange viser særskilte synaptiske egenskaber3,4,5,6,7,8. Retinogeniculate-indgange danner store terminaler med flere udgivelses steder9,10. I modsætning hertil viser kortikogeniculate-indgange små terminaler med enkelt udgivelses steder7. Desuden, retinogeniculate synapser effektivt drev action potentialer af relæ neuroner trods kun udgør 5 − 10% af alle synapser på relæ neuroner3,8,11. Kortikosteroider, på den anden side, tjener som en modulator af retinogeniculate transmissioner ved at kontrollere membranpotentialet af relæ neuroner12,13.
Disse to vigtigste excitatoriske input til relæ neuroner er også funktionelt forskellige. En fremtrædende forskel er den kortsigtede depression af retinogeniculate synapser og den kortsigtede lettelse af kortikogeniculate synapser3,5,8. Kortsigtede plasticitet refererer til et fænomen, hvor synaptisk styrke ændrer sig, når synapse er gentagne gange aktiv inden for en periode på få millisekunder til flere sekunder. Synaptic Release sandsynlighed er en vigtig faktor underliggende kortsigtede plasticitet. Synapser, med en lav start frigivelse sandsynlighed, vise kortsigtet lettelse på grund af ophobning af ca2 + i presynapse og dermed en stigning i frigivelse sandsynlighed observeres ved gentagen aktivitet. I modsætning hertil viser synapser med høj frigivelse sandsynlighed normalt kort tids depression på grund af nedbrydningen af klar-releasable vesikler14. Desuden, desensibilisering af postsynaptiske receptorer bidrager til den kortsigtede plasticitet i nogle high-Release sandsynlighed synapser8,15. Høj frigivelse sandsynlighed og desensibilisering af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsyre (AMPA) receptorer bidrager til den fremtrædende kortsigtede depression af retinogeniculate synapser. I modsætning hertil er sandsynligheden for lav udløsning en kortvarig lettelse af de kortikogeniculerede synapser.
I mus kommer den optiske kanal ind i den dorsale laterale geniculate-kerne (dLGN) fra det caudolaterale område, mens kortikogeniculate fibre kommer ind i dLGN rostroventrally. Afstanden mellem de to indgange giver mulighed for undersøgelse af de individuelle egenskaber af to meget forskellige excitatoriske indgange, som påvirker den samme celle. Her bygger vi på og forbedrer en tidligere beskrevet dissektion metode, hvor retinogeniculate og kortikogeniculate fibre bevares i akutte hjerne skiver3. Vi beskriver derefter den elektrofysiologiske undersøgelse af relæ neuroner og stimulering af retinogeniculate og kortikogeniculate fibre med ekstracellulære stimulerings elektroer. Endelig leverer vi en protokol til påfyldning af relæ neuroner med biocytinel og efterfølgende anatomiske analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en forbedret protokol baseret på en tidligere offentliggjort metode3, som giver mulighed for undersøgelse af den høje sandsynlighed for frigivelse retinogeniculate synapser og lav sandsynlighed for frigivelse kortikogeniculate synapser fra samme skive. Dette er af stor betydning, da disse to indgange interagerer med hinanden for at moduere det visuelle signal transmission: retinogeniculate indgange er den vigtigste excitatoriske drev af relæ neuroner, hvorimod kortikothalamiske in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er blevet finansieret af den tyske forskningsfond (DFG) inden for det kollaborative forsknings Center (SFB) 1134 “funktionelle ensembler” (J.v.E. og X.C.) og forsknings tilskuddet EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
Referências
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
- Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
- Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat’s dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
- Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
- Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
- Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
- Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28, 955-966 (2000).
- Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
- Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
- Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
- Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. . Thalamus. , (1997).
- Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).
- Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
- Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
- Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
- von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
- Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
- Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
- Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
- Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
- Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
- Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
- Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
- Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
- Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
- Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
- Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
- Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
- White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
- Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).
