Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate
Summary
Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l’indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.
Abstract
Il nucleo genetico laterale è la prima stazione di relè per le informazioni visive. I neuroni relè di questo nucleo talamico integrano l’input dalle cellule gangliari della retina e lo proiettano nella corteccia visiva. Inoltre, i neuroni relè ricevono eccitazione dall’alto verso il basso dalla corteccia. I due principali input eccitatori per i neuroni relè differiscono in diversi aspetti. Ogni neurone relè riceve input solo da poche sinapsi retinogeniche, che sono grandi terminali con molti siti di rilascio. Ciò si riflette nell’eccitazione relativamente forte, i neuroni relè ricevono, dalle cellule gangliari della retina. Le sinapsi corticogenie, al contrario, sono più semplici con pochi siti di rilascio e una forza sinaptica più debole. Le due sinapsi differiscono anche nella loro plasticità sinaptica a breve termine. Le sinapsi reticolatiche esologiano hanno un’alta probabilità di rilascio e di conseguenza mostrano una depressione a breve termine. Al contrario, le sinapsi corticogenie hanno una bassa probabilità di rilascio. Le fibre corticogeniche attraversano i nuclei talamici reticolari prima di entrare nel nucleo genetico laterale. Le diverse posizioni del nucleo talamico talamico reticolare (rostrally dal nucleo genetico laterale) e del tratto ottico (ventro-lateralmente dal nucleo genetico laterale) consentono di stimolare sinaple corticogenio o retinogenica separatamente con elettrodi di stimolazione extracellulare. Questo rende il nucleo genetico laterale un’area cerebrale ideale in cui due sinapsi eccitatorie con proprietà molto diverse che incidono sullo stesso tipo di cellula, possono essere studiate contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo per studiare la registrazione dai neuroni relè ed eseguire un’analisi dettagliata della funzione di sinapsi retinogenica e corticogenica nelle fette cerebrali acute. L’articolo contiene un protocollo passo-passo per la generazione di fette cerebrali acute del nucleo genetico laterale e passaggi per la registrazione dell’attività dai neuroni relè stimolando separatamente il tratto ottico e le fibre corticogenice.
Introduction
I neuroni relè del nucleo genetico laterale integrano e trasmettono informazioni visive alla corteccia visiva. Questi neuroni ricevono l’input eccitatorio dalle cellule gangliari tramite sinapsi retinogeniche, che forniscono la principale unità eccitatoria per i neuroni relè. Inoltre, i neuroni relè ricevono input eccitatori dai neuroni corticali tramite sinapsi corticogeni. Inoltre, i neuroni relè ricevono input inibitori da interneuroni locali e neuroni GABAergici del nucleo reticularis thalami1. Il nucleo reticularis thalami è presente come uno scudo tra talamo e corteccia tale che le fibre che proiettano dalla corteccia al talamo e nella direzione opposta devono passare attraverso il nucleo reticularis thalami2.
Gli input retinogenici e gli ingressi corticogenici visualizzano proprietà sinaptiche distinte3,4,5,6,7,8. Ingressi retinogenici formano terminali di grandi dimensioni con più siti di rilascio9,10. Al contrario, gli ingressi corticogenici visualizzano piccoli terminali con siti a rilascio singolo7. Inoltre, le sinapsi retinogeniche guidano in modo efficiente i potenziali di azione dei neuroni relè, nonostante che imredditivi solo il 5-10% di tutte le sinapsi sui neuroni del relè3,8,11. Le sinapsi corticogenice, d’altra parte, fungono da modulatore delle trasmissioni retinogeniculate controllando il potenziale della membrana dei neuroni relè12,13.
Questi due principali input eccitatori per i neuroni relè sono anche funzionalmente diversi. Una differenza importante è la depressione a breve termine delle sinapsi retinogeniche e la facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogenice3,5,8. La plasticità a breve termine si riferisce a un fenomeno in cui la forza sinaptica cambia quando la sinapsi è ripetutamente attiva entro un periodo di tempo di pochi millisecondi a diversi secondi. La probabilità di rilascio sinaptico è un fattore importante alla base della plasticità a breve termine. Le synapsi, con una bassa probabilità di rilascio iniziale, mostrano facilitazione a breve termine a causa dell’accumulo di Ca2 e nella presynapse e di conseguenza un aumento della probabilità di rilascio viene osservato su attività ripetute. Al contrario, le sinapsi con alta probabilità di rilascio di solito mostrano depressione a breve termine a causa dell’esaurimento delle vesciche pronte e riutilizzabili14. Inoltre, la desensibilizzazione dei recettori post-sinaptici contribuisce alla plasticità a breve termine in alcune sinapsi di probabilità ad alto rilascio8,15. Alta probabilità di rilascio e desensibilizzazione dei recettori dell’acido isossiale-5-metil-4-isoxalepropionici (AMPA) che contribuiscono alla depressione a breve termine prominente delle sinapsi retinogeniche. Al contrario, la probabilità a basso rilascio è alla base della facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogeni.
Nei topi, il tratto ottico entra nel nucleo genulato laterale dorsale (dLGN) dal sito caudolaterale, mentre le fibre corticogeniulate entrano nel dLGN rostroventrallyamente. La distanza tra i due ingressi consente di sforare le singole proprietà di due input eccitatori molto diversi che incidono sulla stessa cella. Qui, costruiamo e miglioriamo un metodo di dissezione descritto in precedenza in cui le fibre retinogeniculate e corticogeniule sono conservate nelle fette acute del cervello3. Descriviamo quindi lo studio elettrofisiologico dei neuroni relè e la stimolazione delle fibre retinogenulate e corticogeniulate con elettrodi di stimolazione extracellulare. Infine, forniamo un protocollo per il riempimento dei neuroni relè con biocitina e successiva analisi anatomica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un protocollo migliorato basato su un metodo pubblicato in precedenza3, che consente di sforare l’alta probabilità di rilascio di sinapsi retinogeniche e bassa probabilità di rilascio di sinapsi corticogeneulate dalla stessa fetta. Questo è di grande importanza poiché questi due ingressi interagiscono tra loro per modulare la trasmissione del segnale visivo: gli ingressi retinogeniculati sono la principale unità eccitatoria dei neuroni relè, mentre gli input corticothalamici funz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) all’interno del Centro di ricerca collaborativa (SFB) 1134 “Ensemble funzionali” (J.v.E. e X.C.) e dal Research Grant EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
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