Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate
Summary
Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.
Abstract
O núcleo geniculado lateral é a primeira estação de retransmissão para a informação visual. Os neurônios do relé deste núcleo thalamic integram a entrada das pilhas retinal do gânglio e projetam-na ao córtice visual. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem excitação de cima para baixo do córtex. As duas principais entradas excitatórias para os neurônios de retransmissão diferem em vários aspectos. Cada neurônio do relé recebe a entrada de somente algumas sinapses retinogeniculate, que são grandes terminais com muitos locais da liberação. Isto é refletido pela excitação comparativamente forte, os neurônios do relé recebem, das pilhas retinal do gânglio. As sinapses corticogeniculate, ao contrário, são mais simples com poucos locais da liberação e uma força sináptica mais fraca. As duas sinapses também diferem em sua plasticidade sináptica de curto prazo. As sinapses retinogeniculate têm uma probabilidade elevada da liberação e apresentam conseqüentemente uma depressão a curto prazo. Ao contrário, as sinapses corticogeniculate têm uma baixa probabilidade da liberação. As fibras corticogeniculate atravessam os núcleos thalamic reticular antes de incorporar o núcleo geniculado lateral. Os diferentes locais do núcleo talâmico reticular (rostrally do núcleo geniculado lateral) e do trato óptico (ventro-lateralmente do núcleo geniculado lateral) permitem estimular as sinapses corticogeniculados ou retinogeniculados separadamente com eletrodos de estimulação extracelular. Isto faz o núcleo geniculado lateral uma área ideal do cérebro onde duas sinapses excitatórios com propriedades muito diferentes que colide no mesmo tipo da pilha, podem ser estudadas simultaneamente. Aqui, nós descrevemos um método para investigar a gravação dos neurônios do relé e para executar a análise detalhada da função retinogeniculate e corticogeniculate do sinapse em fatias agudas do cérebro. O artigo contém um protocolo passo-a-passo para a geração de fatias cerebrais agudas do núcleo geniculado lateral e etapas para a atividade de gravação de neurônios de retransmissão, estimulando o trato óptico e as fibras corticogeniculate separadamente.
Introduction
Os neurônios do relé do núcleo geniculado lateral integram e retransmitem a informação visual ao córtice visual. Esses neurônios recebem entrada excitatória de células ganglionares via sinapses retinogeniculadas, que fornecem a principal unidade excitatória para os neurônios de retransmissão. Além, os neurônios do relé recebem entradas excitatórios dos neurônios corticais através das sinapses corticogeniculate. Além disso, os neurônios de retransmissão recebem entradas inibitórias de interneurônios locais e neurônios gabaérgicos do núcleo Livedo reticular thalami1. O núcleo Livedo reticular thalami está presente como um escudo entre o tálamo e o córtex de tal forma que as fibras que projetam do córtex para o tálamo e no sentido oposto devem atravessar o núcleo Livedo reticular thalami2.
As entradas de retinogeniculate e as entradas do corticogeniculate exibem propriedades sinápticasdistintas3,4,5,6,7,8. As entradas do retinogeniculate formam grandes terminais com os locais múltiplos da liberação9,10. Em contrapartida, os insumos corticogeniculados exibem pequenos terminais com locais de liberação única7. Além disso, as sinapses retinogeniculate impulsionam eficientemente potenciais de ação de neurônios de retransmissão, apesar de constituírem apenas 5 − 10% de todas as sinapses nos neurônios de retransmissão3,8,11. As sinapses corticogeniculate, por outro lado, servem como um modulador de transmissões retinogeniculate controlando o potencial de membrana de neurônios de relé12,13.
Estas duas principais entradas excitatórias para retransmissão de neurônios também são funcionalmente diferentes. Uma diferença proeminente é a depressão de curto prazo das sinapses retinogeniculate e a facilitação a curto prazo de sinapses corticogeniculate3,5,8. A plasticidade de curto prazo refere-se a um fenômeno em que a força sináptica muda quando a sinapse é repetidamente ativa dentro de um período de tempo de poucos milissegundos a vários segundos. A probabilidade de liberação sináptica é um fator importante subjacente à plasticidade de curto prazo. As sinapses, com uma baixa probabilidade de liberação inicial, exibem a facilitação a curto prazo devido ao acúmulo de CA2 + na pré-síntese e, consequentemente, um aumento na probabilidade de liberação é observado após a atividade repetida. Em contraste, as sinapses com alta probabilidade de liberação geralmente exibem depressão de curto prazo devido à depleção de vesículas prontas-liberáveis14. Além disso, a dessensibilização dos receptores pós-sinápticos contribui para a plasticidade de curto prazo em algumas sinapses de alta probabilidade de liberação8,15. A probabilidade da liberação elevada e a dessensibilização de receptores do ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) contribuem à depressão a curto prazo proeminente de sinapses retinogeniculate. Por outro lado, a probabilidade de baixa liberação está subjacente à facilitação de curto prazo de sinapses corticogeniculados.
Em camundongos, o trato óptico entra no núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) do local caudolateral, enquanto as fibras corticogeniculate entram no dLGN rostroventrally. A distância entre as duas entradas permite a investigação das propriedades individuais de duas entradas excitatórios muito diferentes que colide na mesma pilha. Aqui, nós construímos sobre e melhoramos um método previamente descrito da dissecção em que as fibras do retinogeniculate e do corticogeniculate são preservadas em fatias agudas do cérebro3. Nós, então, descrevemos a investigação electrofisiológica de neurônios do relé e a estimulação de fibras retinogeniculate e corticogeniculate com os elétrodos extracelular da estimulação. Finalmente, nós fornecemos um protocolo para o enchimento de neurônios do relé com biocytin e a análise anatômica subseqüente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos um protocolo melhorado baseado em um método previamente publicado3, que permita a investigação da probabilidade elevada de sinapses retinogeniculate da liberação e da baixa probabilidade de sinapses corticogeniculate da liberação da mesma fatia. Isto é de grande importância uma vez que estas duas entradas interagem entre si para modular a transmissão do sinal visual: as entradas de retinogeniculate são a movimentação excitatórios principal de neurônios do relé, vis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação alemã de pesquisa (DFG) no centro de pesquisa colaborativa (SFB) 1134 “conjuntos funcionais” (J.v.E. e X.C.) e o subsídio de pesquisa EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
Referências
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