Forbedret Cross Linking Immunoprecipitation (eCLIP) metode til effektiv identifikation af protein-bundet RNA i Mouse testis

Summary

Her præsenterer vi en eCLIP-protokol for at bestemme store RNA-mål for RBP-kandidater i testikler.

Abstract

Spermatogenesis definerer en højt bestilt proces af mandlige kimcelle differentiering i pattedyr. I testis, transkription og oversættelse er afkoblet, understreger betydningen af post-transkriptional regulering af genekspression orkestreret af RBPs. At belyse mekanistiske roller af en RBP, Cross Linking immunopræcipitation (Clip) metode kan bruges til at indfange sine endogene direkte RNA mål og definere de faktiske interaktion sites. Den forbedrede CLIP (eCLIP) er en nyudviklet metode, der giver flere fordele i forhold til de konventionelle CLIPs. Men, brugen af eCLIP har hidtil været begrænset til cellelinjer, der opfordrer til udvidede applikationer. Her har vi ansat eCLIP til at studere MOV10 og MOV10L1, to kendte RNA-bindende helicases, i mus testis. Som forventet, finder vi, at MOV10 overvejende binder sig til 3 ‘ uover satte regioner (UTRs) af mRNA og MOV10L1 selektivt binder sig til Piwi-interagerende RNA (piRNA) forløber transkriptioner. Vores eCLIP-metode giver mulighed for hurtig bestemmelse af større RNA-arter, der er bundet af forskellige RBPs via mindre sekvensering af subkloner og dermed tilgængelighed af kvalificerede biblioteker, som en arrestordre til at fortsætte med dyb sekvensering. Denne undersøgelse fastsætter et relevant grundlag for eCLIP i pattedyrs testikler.

Introduction

Mammale testiklerne repræsenterer en fremragende udviklingsmodel, hvor en indviklet Celledifferentiering program kører cyklisk at give talrige spermatozoer. En unik værdi af denne model ligger i fremkomsten af transkriptional inaktivering på visse stadier af spermatogenesen, typisk når meiotisk sex kromosom inaktivering (MSCI) forekommer^1,2 og når runde spermatider gennemgår drastisk nuklear komprimering under spermiogenesis³. Disse sammenhængende transkriptionsmæssige hændelser nødvendiggør en regulering efter transkriptional gen, hvor RNA-bindende proteiner (RBPs) spiller en afgørende rolle, idet de danner transkriptomer og bevarer fertiliteten hos hanner.

For at identificere de bona fide-RNA-mål for en individuel RBP in vivo, blev Cross Linking immunopræcipitation (Clip) metodenudviklet til^4,5, baseret på, men ud over den regulære RNA immunopræcipitation (RIP)^6,7 , ved inkorporering af centrale trin, herunder ultraviolet (UV) Cross Linking, streng vask og gel overførsel for at forbedre signal specificitet. Den avancerede anvendelse af CLIP kombineret med sekvensering med høj gennemløb har vakt stor interesse i profilering af protein-RNA interaktion på genomdækkende niveauer⁸. Ud over genetiske undersøgelser af RBP-funktion har sådanne biokemiske metoder, der identificerer det direkte samspil mellem endogene proteiner og RNA, været uundværlige for nøjagtigt at belyse de RNA-regulerende roller for RBPs. For eksempel er MOV10L1 en testis-specifik RNA helicase kræves for mandlig fertilitet og Piwi-interagerende RNA (Pirna) Biogenese⁹. Parallogue MOV10 er kendt som en allestedsnærværende og multifunktionelle RNA helicase med roller i flere aspekter af RNA biologi^{10,11,12,13,14 , 15} af ^{, 16} ud af ^{, 17} ud af ^{, 18}. ved at ansætte den konventionelle Clip-SEQ, vi fandt, at MOV10L1 binder og regulerer primære Pirna prækursorer til at initiere tidlig Pirna behandling^19,20, og at MOV10 binder mRNA 3 ‘ utrs og samt Noncoding RNA arter i testikel kimceller (data ikke vist).

Ikke desto mindre, CLIP er oprindeligt en besværlig, radioaktiv procedure efterfulgt af sekvensering bibliotek forberedelse med et bemærkelsesværdigt tab af CLIP Tags. I den konventionelle CLIP, er et cDNA bibliotek forberedt ved hjælp af adaptere ligeret ved begge RNA ekstremiteter. Efter protein fordøjelsen forbliver kryds sammenkædede korte polypeptider knyttet til RNA-fragmenter. Dette kryds bindende mærke delvist blokerer reverse transkriptase (rtase) progression under cDNA syntese, hvilket resulterer i afkortede cdnas, som repræsenterer omkring 80% af cDNA Library^21,22. Således er det kun cDNA-fragmenter som følge af RTase, der springer over Cross Linking-stedet (læse-through), der er sekvenseret. For nylig, forskellige CLIP tilgange, såsom PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP og uvCLAP, har været ansat til at identificere crosslink sites af RBPs i levende celler. PAR-CLIP involverer anvendelse af 365 nm UV-stråling og fotoaktivatable nukleotidanalotter og er derfor eksklusivt til in-culturing levende celler, og inkorporering af nukleosid analoler i nysyntetiserede udskrifter er tilbøjelige til at producere bias hvor RNA fysisk interagerer med protein^23,24. I iCLIP er det kun en enkelt adapter, der er ligeret til de 3 ‘ ekstremiteter af crosslinked RNA-fragmenter. Efter reverse transkription (RT), er både afkortet og læse-gennem cdnas opnået ved intramolecularly cirkularisering og re-linearisering efterfulgt af polymerase kædereaktion (PCR) amplifikation^25,26. Effektiviteten af intramolekylær cirkularisering er dog relativt lav. Selv om ældre CLIP-protokoller har brug for mærkning af crosslinked RNA med en radioisotop, ultraviolet Cross linking og Affinity rensning (uvCLAP), med en proces med streng tandem affinitets rensning, er ikke afhængig af radioaktivitet²⁷. Ikke desto mindre er uvCLAP begrænset til kultiverede celler, der skal transficeret med udtrykket vektor bærer 3x FLAG-HBH tag for tandem affinitet rensning.

I eCLIP blev adaptere ligeret først ved 3 ‘ ekstremiteten af RNA efterfulgt af RT, og derefter ved 3 ‘ ekstremiteterne af cDNAs i en intermolekylær tilstand. Derfor er eCLIP i stand til at indfange alle afkortet og læse-through cDNA²⁸. Også, det er hverken begrænset til radioaktiv mærkning, eller at bruge cellelinjer baseret på dens princip, samtidig med at enkelt-nukleotid opløsning.

Her giver vi en trinvis beskrivelse af en eCLIP-protokol, der er tilpasset musens testikler. Kort, denne eclip protokol starter med UV tværbinding af testikel tubuser, efterfulgt af delvis RNase fordøjelse og immunopræcipitation ved hjælp af et protein-specifikt antistof. Dernæst er det proteinbundne RNA dephosphoryleret, og adapteren er ligeret til dens 3 ‘ ende. Efter protein gel elektroforese og overførsel af gel til membran isoleres RNA ved at skære membran arealet af et forventet størrelsesinterval. Efter RT er DNA-adapteren ligeret til 3 ‘ enden af cDNA efterfulgt af PCR-forstærkning. Screening af subkloner forud for sekventering med høj hastighed tages som en Biblioteks kvalitetskontrol. Denne protokol er effektiv til at identificere de vigtigste arter af protein-bundet RNA af RBPs, eksemplificeret ved de to testis-udtrykker RNA helicases MOV10L1 og MOV10.

Protocol

Alle udførte dyreforsøg er blevet godkendt af Nanjing Medical University Committee. Mand C57BL/6-mus blev holdt under kontrollerede lysdrifts betingelser og blev forsynet med mad og vand. 1. vævs høst og UV crosslinking Euthanize 2 voksne mus bruger kuldioxid (CO2) for 1-2 min eller indtil vejrtrækningen stopper. Derefter skal du udføre cervikal dislokation på hver mus. Høst omkring 100 mg testiklerne fra mus i passende alder (en voksen testikler i dette …

Representative Results

Eclip-proceduren og resultaterne er illustreret i figur 1, figur 2, figur 3, figur 4. Mus blev aflives med kuldioxid og en lille indsnit blev foretaget i den nedre abdomen ved hjælp af kirurgiske saks (figur 2a,B). Muse tes…

Discussion

Med stigende forståelse af den universelle rolle af rbps under både biologiske og patologiske sammenhænge, er klippet metoder blevet bredt udnyttet til at afsløre den molekylære funktion af rbps^{20,32,33, 34af35}. Den protokol, der beskrives her, repræsenterer en tilpasset anvendelse af eCLIP-metoden til muse testikler.

En udfo…

Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876