Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo de eCLIP para determinar alvos principais do RNA de candidatos do RBP no testis.

Abstract

A espermatogênese define um processo altamente ordenado de diferenciação de células germinativas masculinas em mamíferos. No testis, a transcrição e a tradução são desacopladas, sublinhando a importância da regulação pós-transcripcional da expressão gênica orquestrada por RBPs. Para elucidar papéis mecanísticos de um RBP, a metodologia da imunoprecipitação da reticulação (grampo) pode ser usada para capturar seus alvos diretos endógenos do RNA e para definir os locais reais da interação. O grampo realçado (eCLIP) é um método recentemente desenvolvido que ofereça diversas vantagens sobre os grampos convencionais. No entanto, o uso do eCLIP foi até agora limitado a linhas de célula, chamando para aplicativos expandidos. Aqui, nós empregamos eCLIP para estudar MOV10 e MOV10L1, dois helicases conhecidos do RNA-emperramento, no testis do rato. Como esperado, nós encontramos que MOV10 se liga predominantly a 3 ‘ as regiões Untranslated (UTRs) de mRNA e MOV10L1 ligam seletivamente às transcrições do precursor do RNA Piwi-interagindo (piRNA). Nosso método eCLIP permite a determinação rápida de espécies de RNA principais vinculadas por vários RBPs através de sequenciamento em pequena escala de subclones e, portanto, disponibilidade de bibliotecas qualificadas, como um mandado para prosseguir com sequenciamento profundo. Este estudo estabelece uma base aplicável para eclip no testis mamíferos.

Introduction

O testis mammalian representa um modelo desenvolvente excelente onde um programa intricado da diferenciação da pilha funcione ciclicamente para render espermatozóides numerosos. Um valor único deste modelo reside no surgimento da inativação transcricional em determinados estágios da espermatogênese, tipicamente quando a inativação do cromossomo meiótico (MSCI) ocorre^1,2 e quando os espermatozídeos redondos sofrem compactação nuclear drástica durante a spermiogênese³. Estes eventos transcricional inconsecutivos necessitam a regulação borne-transcricional do gene, em que as proteínas RNA-obrigatórias (rbps) jogam um papel crucial, dando forma ao transcriptoma e mantendo a fertilidade masculina.

Para identificar os alvos de RNA de bona fide de uma RBP individual in vivo, o método da imunoprecipitação de reticulação (clip) foi desenvolvido^4,5, com base no mas além da imunoprecipitação de RNA regular (RIP)^6,7 , pela incorporação de etapas chaves que incluem a reticulação ultravioleta (UV), a lavagem estrita e a transferência do gel para melhorar a especificidade do sinal. A aplicação avançada do grampo combinada com o seqüenciamento da elevado-taxa de transferência provocou o grande interesse na interação da proteína-RNA do perfil em níveis do genoma-largo⁸. Além do que estudos genéticos na função de RBP, tais métodos bioquímicos que identificam a interação direta da proteína endógena e do RNA foram indispensáveis para elucidar exatamente os papéis regulatórios do RNA de RBPs. Por exemplo, MOV10L1 é um helicase do RNA do testis-específico exigido para a fertilidade masculina e a biogênese Piwi-interagindo do RNA (piRNA)⁹. Seu MOV10 do parálogo é sabido como um helicase ubiquitously expressado e multifunctional do RNA com papéis em aspectos múltiplos da biologia do RNA¹⁰,^{11,12,13,14 , 15 anos} de ^{, 16 anos} de ^{, 17 anos} de ^{, 18}. empregando o clip-Seq convencional, nós encontramos que MOV10L1 liga e regula precursores preliminares de Pirna para iniciar o processamento adiantado de Pirna^19,20, e esse MOV10 liga UTRs de mRNA 3 ‘ e assim como o RNA RNAs espécies em células germinativas testiculares (dados não mostrados).

No entanto, CLIP é originalmente um procedimento laborioso, radioativo seguido de sequenciamento de preparação da biblioteca com uma notável perda de Tags CLIP. No clipe convencional, uma biblioteca de cDNA é preparada usando adaptadores ligados em ambas as extremidades do RNA. Após a digestão da proteína, os polypeptídeos curtos reticulados permanecem unidos aos fragmentos do RNA. Esta marca de reticulação bloqueia parcialmente a progressão da transcriptase reversa (RTase) durante a síntese do cDNA, resultando em cDNAs truncados que representam cerca de 80% da biblioteca do cDNA^21,22. Assim, apenas os fragmentos de cDNA resultantes de RTase ignorando o site de reticulação (read-through) são seqüenciados. Recentemente, as várias aproximações do grampo, tais como PAR-grampo, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, foram empregadas para identificar os locais da ligação cruzada de RBPs em pilhas vivas. O par-grampo envolve a aplicação da radiação UV de 365 nanômetro e dos análogos photoactivatable do nucleotide e é conseqüentemente exclusivo às pilhas vivas in-culturing, e a incorporação de análogos do nucleosídeo em transcritos recentemente sintetizados é propenso a produzir a polarização onde o RNA interage fisicamente com a proteína^23,24. No iCLIP, apenas um único adaptador é ligado à extremidade 3 ‘ de fragmentos de RNA reticulado. Após a transcrição reversa (RT), ambos os cDNAs truncados e lidos são obtidos por circularização intramolecularmente e relinearização seguida pela amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR)^25,26. Entretanto, a eficiência da circularização intramolecular é relativamente baixa. Embora os protocolos mais velhos do grampo precisem de etiquetar do RNA reticulado com um radioisótopo, reticulação ultravioleta e purificação da afinidade (uvCLAP), com um processo de purificação em tandem estrita da afinidade, não confia na radioactividade²⁷. Não obstante, uvCLAP é limitado às pilhas cultivadas que devem ser transfected com o vetor da expressão que carreg a etiqueta de 3x FLAG-HBH para a purificação em tandem da afinidade.

Em eCLIP, os adaptadores foram ligados primeiramente na extremidade 3 ‘ do RNA seguido pelo RT, e em seguida na extremidade 3 ‘ dos cDNAs em uma modalidade intermolecular. Assim, o eCLIP é capaz de capturar todos os cDNA²⁸truncados e lidos. Além disso, não é restrito à rotulagem radioativa, nem ao uso de linhas celulares com base em seu princípio, mantendo a resolução de nucleotídeo único.

Aqui, nós fornecemos uma descrição passo a passo de um protocolo eCLIP adaptado para testagem do mouse. Momentaneamente, este protocolo de eCLIP começa com reticulação UV de tubules testicular, seguidos pela digestão parcial de RNase e pela imunoprecipitação usando um anticorpo proteína-específico. Em seguida, o RNA proteína-ligado é dephosphorylated, e o adaptador é ligado a sua extremidade 3 ‘. Após a electroforese do gel da proteína e a transferência da gel-à-membrana, o RNA é isolado cortando a área da membrana de uma escala esperada do tamanho. Após RT, o adaptador do ADN é ligado à extremidade 3 ‘ do cDNA seguido pela amplificação do PCR. O rastreamento de subclones antes do sequenciamento de alta taxa de transferência é tomado como um controle de qualidade de biblioteca. Este protocolo é eficiente na identificação das principais espécies de RNA proteico-dependente de RBPs, exemplificada pelos dois testamentos expressando RNA helicases MOV10L1 e MOV10.

Protocol

Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê da universidade médica de Nanjing. Camundongos machos C57BL/6 foram mantidos condições controladas de fotoperíodo e foram fornecidos com alimentos e água. 1. colheita de tecidos e reticulação UV Eutanizar 2 camundongos adultos usando dióxido de carbono (CO2) por 1-2 min ou até que a respiração pare. Em seguida, realize a deslocação cervical em cada rato. Colha cerca de 100 mg de…

Representative Results

O procedimento eclip e os resultados são ilustrados na figura 1, figura 2, figura 3, Figura 4. Camundongos foram eutanasiados com dióxido de carbono e uma pequena incisão foi feita no abdome inferior por meio de tesoura cirúrgica (Figura 2a</stro…

Discussion

Com a compreensão crescente do papel universal de rbps contextos biológicos e patológicos, os métodos do grampo foram utilizados extensamente para revelar a função molecular de rbps^20,32,^{33, 34,35}. O protocolo descrito aqui representa uma aplicação adaptada do método de eCLIP ao testis do rato.

Um desafio em executar eCLIP…

Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876