Verbeterde crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) methode voor efficiënte identificatie van proteïne-verbindend RNA in muis testis

Summary

Hier presenteren we een eCLIP protocol om de belangrijkste RNA doelen van RBP kandidaten in testis te bepalen.

Abstract

Spermatogenese definieert een zeer besteld proces van mannelijke kiemcellen differentiatie bij zoogdieren. In testis, worden de transcriptie en de vertaling ontkoppeld, onderstrepend het belang van post-transcriptie regelgeving van de uitdrukking van het gen die door RBPs wordt georkestreerd. Om mechanistische rollen van een RBP op te helderen, kan de methodologie van crosslinking Immunoprecipitation (klem) worden gebruikt om zijn endogene directe doelstellingen van RNA te vangen en de daadwerkelijke interactie plaatsen te bepalen. De Enhanced CLIP (eCLIP) is een nieuw ontwikkelde methode die verschillende voordelen biedt ten opzichte van de conventionele CLIPs. Nochtans, is het gebruik van eCLIP tot dusver beperkt tot cel lijnen, die voor uitgebreide toepassingen roepen. Hier werkten wij eCLIP om MOV10 en MOV10L1, twee bekende RNA-bindende helicases, in muis testis te bestuderen. Zoals verwacht, vinden wij dat MOV10 hoofdzakelijk aan 3 ‘ onvertaalde gebieden (UTRs) van mRNA bindt en MOV10L1 selectief aan piwi-interactie RNA (piRNA) voorloper transcripten bindt. Onze eCLIP methode maakt een snelle bepaling van de grote RNA-soorten gebonden door verschillende RBPs via kleinschalige sequencing van subklonen en dus de beschikbaarheid van gekwalificeerde Bibliotheken, als een waarborg voor de procedure met diepe sequencing. Deze studie stelt een toepasbare basis vast voor eCLIP in zoogdier testis.

Introduction

De testis van zoogdieren vertegenwoordigt een uitstekend ontwikkelingsmodel waarin een ingewikkeld programma van de cel differentiatie cyclisch loopt om talrijke spermatozoa op te leveren. Een unieke waarde van dit model ligt in de opkomst van transcriptie inactivatie in bepaalde stadia van spermatogenese, meestal wanneer Meiotische geslacht chromosoom inactivatie (MSCI) voorkomt^1,2 en wanneer ronde spermatids ondergaan drastische kern verdichting tijdens spermiogenesis³. Deze inopeenvolgende transcriptie gebeurtenissen vereisen post-transcriptie de regelgeving van het gen, waarin RNA-bindende proteïnen (RBPs) een essentiële rol spelen, die transcriptoom en het handhaven van mannelijke vruchtbaarheid vormen.

Om de bona fide doelen van RNA van een individuele RBP in vivo te identificeren, werd de crosslinking Immunoprecipitation (clip) methode ontwikkeld^4,5, gebaseerd op maar buiten de reguliere RNA Immunoprecipitation (RIP)^6,7 , door integratie van belangrijke stappen met inbegrip van ultraviolette (UV) crosslinking, stringente was en gel overdracht om signaal specificiteit te verbeteren. De geavanceerde toepassing van de CLIP in combinatie met een hoge doorvoersnelheid sequencing heeft uitgelokt grote belangstelling voor profilering eiwit-RNA interactie op genoom-Wide levels⁸. Naast genetische studies over RBP functie, zijn dergelijke biochemische methodes die het directe samenspel van endogene proteïne en RNA identificeren onontbeerlijk geweest om de regelgevende rollen van RNA van RBPs nauwkeurig te verhelderen. Bijvoorbeeld, MOV10L1 is een testikel-specifiek RNA Helicase vereist voor mannelijke vruchtbaarheid en de piwi-interactie RNA (piRNA) biogenesis⁹. Zijn paralogue MOV10 is gekend als een ubiquitously uitgedrukt en multifunctioneel RNA Helicase met rollen in veelvoudige aspecten van de biologie van RNA^{10, 11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18}. door het gebruik van de conventionele clip-volgende, vonden we dat MOV10L1 bindt en reguleert primaire piRNA precursoren te initiëren vroege piRNA verwerking^19,20, en dat MOV10 bindt mRNA 3 ‘ UTRs en als niet-codering RNA soorten in testiculaire kiemcellen (gegevens niet getoond).

Niettemin, CLIP is oorspronkelijk een moeizame, radioactieve procedure gevolgd door sequencing bibliotheek voorbereiding met een opmerkelijk verlies van CLIP Tags. In de conventionele CLIP, is een cDNA Bibliotheek bereid met behulp van adapters afgebonden op beide RNA ledematen. Na de eiwitvertering, kruisverwijzende korte polypeptiden blijven gehecht aan RNA fragmenten. Dit crosslinking merk blokkeert gedeeltelijk omgekeerde transcriptase (RTase) progressie tijdens cDNA synthese, resulterend in afgekapte cDNAs die ongeveer 80% van de cDNA Bibliotheek^21,22vertegenwoordigen. Dus alleen cDNA fragmenten als gevolg van RTase het omzeilen van de crosslinking site (Read-Through) worden gesequenced. Onlangs, zijn diverse klem benaderingen, zoals pari-klem, iCLIP, eCLIP en uvCLAP, gebruikt om crosslink plaatsen van RBPs in levende cellen te identificeren. PAR-CLIP omvat de toepassing van 365 nm UV-straling en photoactivatable nucleotide analogen en is daarom exclusief voor in-kweken levende cellen, en de integratie van nucleoside analogen in nieuw gesynthetiseerde Transcripten is vatbaar voor het produceren bias waar RNA fysisch met proteïne^23,24samenwerkt. In iCLIP, slechts een enkele adapter is afgebonden aan de 3 ‘ extremiteit van kruisverwijzende RNA fragmenten. Na omgekeerde transcriptie (RT), zowel worden de afgekapte als gelezen-door cDNAs verkregen door intramolecularly circularization en re-linearization die door de Kettingreactie van de polymerase (PCR) wordt gevolgd^25,26. Echter, de efficiëntie van intramoleculaire circularization is relatief laag. Hoewel oudere CLIP protocollen moeten etikettering van kruisverwijzende RNA met een isotoop, ultraviolette crosslinking en affiniteit zuivering (uvCLAP), met een proces van strenge tandem affiniteit zuivering, vertrouwt niet op radioactiviteit²⁷. Niettemin is uvCLAP beperkt tot gekweekte cellen die moeten worden transfected met de expressievector die de 3x FLAG-HBH tag voor tandem affiniteit zuivering draagt.

In eCLIP, adapters werden afgebonden eerste op de 3 ‘ extremiteit van RNA gevolgd door RT, en de volgende op de 3 ‘ extremiteit van cDNAs in een intermoleculaire modus. Vandaar, eCLIP is in staat om vast te leggen alle afgekapt en lees-through cDNA²⁸. Ook is het niet beperkt tot radioactieve etikettering, noch om het gebruik van cel lijnen op basis van zijn principe, met behoud van single-nucleotide resolutie.

Hier bieden we een stap-voor-stap beschrijving van een eCLIP protocol aangepast voor de muis testis. Kort, dit eCLIP protocol begint met UV-crosslinking van testiculaire tubuli, gevolgd door gedeeltelijke ASE spijsvertering en Immunoprecipitation met behulp van een eiwit-specifieke antilichaam. Vervolgens, naar de proteïne-gebonden RNA zit gedefosforyleerd, en bewerker zit afgebonden voor zijn 3 ‘ uiterste. Na eiwit Elektroforese van het gel en gel-aan-membraan overdracht, wordt RNA geïsoleerd door het membraan gebied van een verwachte groottewaaier te snijden. Na RT, is de adapter van DNA afgebonden aan 3 ‘ eind van cDNA die door PCR versterking wordt gevolgd. Screening van subklonen voorafgaand aan high-throughput sequencing wordt genomen als een bibliotheek kwaliteitscontrole. Dit protocol is efficiënt bij het identificeren van belangrijke soorten van proteïne-verbindend RNA van RBPs, dat door twee wordt geïllustreerd testis-uitdrukt RNA helicases MOV10L1 en MOV10.

Protocol

Alle uitgevoerde dierproeven zijn goedgekeurd door de Nanjing Medical University Comite. De mannelijke C57BL/6 muizen werden gehouden onder gecontroleerde fotoperiode voorwaarden en werden voorzien van voedsel en water. 1. weefsel oogsten en UV crosslinking Euthanaseren 2 volwassen muizen met behulp van kooldioxide (CO2) voor 1-2 min of tot de ademhaling stopt. Vervolgens voert u cervicale dislocatie op elke muis. Oogst ongeveer 100 mg testes van muizen van gesch…

Representative Results

De eCLIP procedure en de resultaten worden geïllustreerd in figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4. Muizen werden euthanized met koolstofdioxide en een kleine incisie werd gemaakt in de onderbuik met behulp van chirurgische schaar (Figuur 2a</strong…

Discussion

Met het toenemende begrip van de universele rol van RBPs onder zowel biologische als pathologische contexten, zijn de klem methodes wijd gebruikt om de moleculaire functie van RBPs^20,32,33te openbaren^{, 34,35}. Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een aangepaste toepassing van de eCLIP-methode op muis testis.

Een uitdaging i…

Materials

Antibodies
Anti-mouse MOV10  antibody	Proteintech, China	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175	provided by P. Jeremy Wang lab（University of Pennsylvania）
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, China	A7016
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242R
Digital sonifier	BRANSON,USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen,USA	12321D
Mini Blot Module	Invitrogen,USA	B1000
Mini Gel Tank	Invitrogen,USA	A25977
Shaking incubator	Eppendorf, Hamburg, Germany	Thermomixer comfort
Tissue Grinder, Dounce	PYREX, USA	1234F35	only  the "loose" pestle is used in this protocol
TProfessional standard 96 Gradient	Biometra, Germany	serial no.: 2604323
Tube Revolver	Crystal, USA	serial no.: 3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Microtubes tubes	AXYGEN , USA	MCT-150-C	1.5 mL
Reagents
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol	Solarbio, China	P1011	25:24:01
AffinityScript Enzyme	Agilent, USA	600107
Antioxidant	Invitrogen,USA	NP0005
DH5α competent bacteria	Thermo Scientific, USA	18265017	these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction.
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D8418
DNA Ladder	Invitrogen, USA	10416014
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
Dynabeads Protein A	Invitrogen, USA	10002D
ECL reagent	Vazyme, China	E411-04
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001	add fresh
Exo-SAP-IT	Affymetrix, USA	78201	PCR Product Cleanup Reagent
FastAP enzyme	Thermo Scientific, USA	EF0652
LDS Sample Buffer	Thermo Scientific, USA	NP0007
MetaPhor Agarose	lonza, Switzerland	50180
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G
MiniElute gel Extraction	QIAGEN, Germany	28604	column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)
MyONE Silane beads	Thermo Scientific, USA	37002D	nucleic acids extraction magnetic beads
NaCl	Invitrogen,USA	AM9759
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels	Invitrogen, USA	NP0336BOX	4%–12%,1.5 mm, 15-well
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit	Invitrogen, USA	NP0050
PBS	Gibco, USA	10010023
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube	TIANGEN, China	WM5-2302831
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems, USA	A25742
proteinase K	NEB, New England	P8107S
Q5 PCR master mix	NEB, New England	M0492L
RLT buffer	QIAGEN, Germany	79216	RNA purification lysis buffer
RNA Clean & Concentrator-5 columns	ZYMO RESEARCH, USA	R1016	RNA purification and concentration columns
RNase I	Invitrogen, USA	AM2295
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
RQ1 DNase	Promega,USA	M610A
Sample Reducing Agent	Invitrogen,USA	NP0009
SDS Solution	Invitrogen, USA	15553027	10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich, USA	30970	protect from light
T4 PNK enzyme	NEB, New England	M0201L
T4 RNA ligase 1 high conc	NEB, New England	M0437M
TA/Blunt-Zero Cloning Mix	Vazyme, China	C601-01
TBE	Invitrogen,USA	AM9863
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027
Triton X-100	Sangon Biotech, China	A600198
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560
Urea	Sigma-Aldrich, USA	U5378
X-ray Films	Caresteam, Canada	6535876