면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비
Summary
이 보고는 면역성 화학을 위한 동결된 마우스 망막 단면도를 준비하기 위한 포괄적인 방법을 기술합니다 (IHC). 설명된 방법은 안구 후방 컵의 해부, 파라포름알데히드 고정, 최적 절삭 온도(OCT) 매체 및 조직 배향에 포함, 단면화 및 면역 염색을 포함한다.
Abstract
면역 조직 화학 (IHC)를 위한 고품질 마우스 눈 단면도의 준비는 망막 구조물 및 기능을 평가하고 망막 질병의 근본적인 기계장치를 결정하기를 위해 중요합니다. 조직 준비 전반에 걸쳐 구조적 무결성을 유지하는 것은 재현 가능한 망막 IHC 데이터를 얻는 데 필수적이지만 망막 세포아키텍처의 취약성과 복잡성으로 인해 어려울 수 있습니다. 10% 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강한 고착제는 망막 구조를 최적으로 보존하며, 종종 배경 형광을 향상시키고 항체-에피토프 상호작용을 감소시킴으로써 IHC 분석을 방해합니다. 온화한 고착제는, 4% 파라포름알데히드와 같이, 배경 형광 및 에피토프 마스킹을 감소시키고, 세심한 해부 기술은 망막 구조물을 보존하기 위하여 이용되어야 합니다. 이 문서에서는, 우리는 망막 구조 무결성의 손실 없이 대부분의 항체 에피토프 상호 작용을 보존하기에 충분한 IHC를 위한 마우스 안구 후방 컵을 준비하는 포괄적인 방법을 제시합니다. 우리는 최적이고 최적이 아닌 조건 하에서 조직 보존 및 방향을 설명하기 위해 다양한 망막 세포 유형 마커에 대한 항체를 가진 대표적인 IHC를 포함합니다. 우리의 목표는 안구 후방 컵 해부에서 IHC에 완전한 프로토콜을 제공하여 망막의 IHC 연구를 최적화하는 것입니다.
Introduction
면역 조직 화학 (IHC)는 1,2,3의조직에서 특정 단백질 과 세포 구조를 국소화하기위한 강력한 기술입니다. 복잡한 조직의 부적절한 고정 방법 및 최적 절편은 조직 구조를 방해하거나, 높은 배경 염색을 생성하거나 항체 에피토프 상호 작용을 감소시켜 유물을 염색하고 결과적으로 잘못된 해석을 초래할 수 있습니다. IHC 데이터4. 척추동물 망막은 상호 연결된 광수용체, 인터뉴런 및 신경절 세포의 지층으로 구성된 복잡하고 고도로 조직된 신경 기관이기 때문에 매우 취약하며 해부 및 절편 중에 쉽게 중단 될 수 있습니다. 마우스 눈 해부 및 면역 염색에 이르는 상세하고 표준화되고 검증된 프로토콜은 IHC 아티팩트를 크게 감소시켜 결과의 신뢰성을 높이고 보다 정확한 비교 데이터를 가능하게 합니다. 분석.
IHC를 위한 조직 준비를 위한 많은 프로토콜이 있습니다, 그러나, 모두가 망막 조직을 위해 적당하지 않습니다. 10 % 포르말린 또는 Bouin의 용액과 같은 강력한 고정제는 해부 및 절편동안망막 구조를 보존5 . 불행하게도, 강한 고정식은 종종 에피토프 6의 화학적 변형으로 인해 향상된 배경 형광및 에피토프 마스킹으로 이어질 . 다른 한편으로는, 온화한 고착제, 같은 4% 파라 포름 알데히드 (PFA) 이러한 유물의 일부를 완화 수 있지만 최적의 망막 구조를 보존하기 위해 세심한 해부 및 단면이 필요합니다. PFA는 조직을 빠르게 관통하지만 단백질을 매우 느리게 연결하여 에피토프 마스킹의 위험을 줄입니다. 짧은 시간 PFA 배양은 상대적으로 온화한 고정이기 때문에, 조직은 수시로 항원을 보존하기 위하여 급속한 동결을 요구합니다. 그들은 왜곡세포와 조직의 무결성을 손상으로 조직 동결 동안 얼음 결정형성을 방지하는 것이 중요하다 7.
여기서는 일관되고 신뢰할 수 있는 IHC 데이터를 산출하는 마우스 안구 후방 컵의 해부, 고정 및 냉동 보호를 위한 상세하고 표준화된 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 망막 절제술은 마우스 눈의 작은 크기와 모양과 망막 조직의 취약성으로 인해 섬세한 과정입니다. 고품질 해부를 수행하는 것은 연습의 문제이지만, 상세한 프로토콜을 갖는, 효율적인 방법과 팁을 제공하는 것은 망막 절편과 IHC를 얻기 위해 필수적이다. 여기에 설명된 프로토콜 외에도 재현 가능한 IHC에 적합한 일관된 고품질 망막 섹션을 허용하는 몇 가지 팁이 있습니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (RO1-GMO97327)와 대학 연구 재단 (UPenn)의 기금에 의해 지원되었다. 우리는 특히 면역 조직 화학 프로토콜, 고든 루텔 (펜실베니아 대학) 및 현미경 검사법과 레슬리 킹, 이 원고를 읽는 중요한 박사에 대한 지원을 위한 펜실베니아 수의사 이미징 코어를 개발하는 그녀의 도움에 대한 스베틀라나 사비나 감사 .
Materials
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
Referências
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- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
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