免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製
Summary
本報告では、免疫組織化学(IHC)のための凍結マウス網膜切片を準備するための包括的な方法について説明する。 記載された方法は、眼後カップの解剖、パラホルムアルデヒド固定、最適切断温度(OCT)培媒体および組織配向への埋め込み、断断および免疫染色を含む。
Abstract
免疫組織化学(IHC)のための高品質のマウス眼科の準備は、再生体の構造と機能を評価し、および再生疾患の根底にあるメカニズムを決定するために重要です。組織の調製全体を通じて構造的完全性を維持することは、再現可能な再生可能な再生IHCデータを得るために不可欠ですが、再生細胞構造の脆弱性と複雑さのために困難な場合があります。10%ホルマリンまたはBouinの溶液のような強力な固定剤は、尾膜構造を最適に保存し、それらはしばしば背景蛍光および/または減少する抗体エピトープ相互作用を増強することによってIHC分析を妨げる、エピトープマスキングとして知られているプロセスである。一方、穏やかな固定剤は、4%パラホルムアルデヒドのように、背景蛍光およびエピトープマスキングを減少させ、細心の注意を払って解剖技術を利用して、尾膜構造を維持しなければならない。本稿では、網膜構造完全性を損なうことなく、ほとんどの抗体エピトープ相互作用を維持するのに十分なIHC用マウス眼後カップを調製する包括的な方法を提示する。我々は、最適かつ最適でない条件下で組織の保存と向きを示すために、様々な再生細胞型マーカーに対する抗体を有する代表的なIHCを含む。私たちの目標は、眼後カップ解剖からIHCへの完全なプロトコルを提供することにより、網膜のIHC研究を最適化することです。
Introduction
免疫組織化学(IHC)は、その中の組織における特定のタンパク質および細胞構造を局所化するための強力な技術である1,2,3.複雑な組織の不適切な固定方法と最適でない断面は、組織構造を破壊し、高いバックグラウンド染色を生成したり、抗体エピトープ相互作用を減少させたり、染色アーティファクトおよび結果的に誤解を招く可能性があります。IHC データ4.脊椎動物網膜は、相互接続された光受容体、インターニューロンおよび神経節細胞の層から構成される複雑で高度に組織化された神経器官であり、非常に壊れやすく、解剖および切断中に容易に破壊されうる。マウスの眼の解剖とオリエンテーションから免疫染色までの詳細で標準化された検証済みのプロトコルは、IHCアーティファクトを大幅に削減し、結果の信頼性を高め、より正確な比較データを可能にします。分析。
IHCの組織調製のための多くのプロトコルがありますが、すべてがリニア組織に適しているわけではありません。10%ホルマリンやBouinの溶液のような強力な固定剤は、解剖および断面5の間に尾膜構造を保持する。残念ながら、強力な固定剤は、多くの場合、エピトープ6の化学修飾による強化された背景蛍光およびエピトープマスキングにつながる。一方、4%パラホルムアルデヒド(PFA)のような穏やかな固定剤は、これらのアーティファクトの一部を緩和することができますが、最適な尾膜構造を維持するために細心の解剖と断面が必要です。PFAは急速に組織に浸透するが、タンパク質を非常にゆっくりと交差させるので、エピトープマスキングのリスクを低減する。短時間のPFAインキュベーションは比較的軽度の固定であるため、組織はしばしば抗原を保存するために急速な凍結を必要とする。細胞や組織の完全性を歪め、損傷するので、組織凍結中の氷の結晶形成を避けることは重要です7.
ここでは、一貫性のある信頼性の高いIHCデータを生み出すマウス眼後カップの解剖、固定、およびクライオ保護のための詳細で標準化されたプロトコルについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス網膜解剖は、マウスの目の小さなサイズと形状と網膜組織の脆弱性による繊細なプロセスです。高品質の解剖を行うことは実践の問題ですが、詳細なプロトコルを持って、効率的な方法とヒントを提供することは、再生部とIHCを得るために必要です。ここで説明するプロトコルに加えて、再現可能な IHC に適した一貫した高品質の整膜セクションを可能にするいくつかのヒントがあり?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、NIH(RO1-GMO97327)と大学研究財団(UPenn)の資金で支援されました。特にスヴェトラーナ・サヴィーナが免疫組織化学プロトコル、ゴードン・ルセル(ペンシルバニア大学)、ペン・ヴェット・イメージング・コアの顕微鏡検査とレスリー・キング博士の助けを借りて、この原稿を批判的に読んでくれたことに感謝します。.
Materials
| 6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm) | Gilson | #MA-48 | For liquid nitrogen (Figure 1E) |
| Aluminum foil | |||
| Cauterizer | Bovie | #AA01 | To mark eye orientation (Figure 1A) |
| Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent | Electron Microscopy Sciences | #72703-D | For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A) |
| Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | #15002-08 | To circumferentially cut the cornea (Figure 1B) |
| Dental wax-coated 35mm dissection dish | For eye cup dissection (Figure 1C) | ||
| Dissecting microscope | Leica, Houston, USA | MZ12.5 High-performance stereomicroscope | |
| Micro Knives – Plastic Handle | Fine Science Tools | #10315-12 | To make a small incision at the burn mark (Figure 1A) |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | #72660 | For coating dissection dish |
| Slide Rack and Coverplate | Ted Pella | #36107 | For retinal IHC (Figure 1G) |
| Stainless Steel Beaker (89 x 114mm) | Gilson | #MA-40 | For isopentane bath (Figure 1E) |
| Styrofoam box | For insulated cooler | ||
| Thin forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | #11254-20 | To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B) |
| Tissue-Tek cryomold (10mm x 10mm x 5mm) | Electron Miscroscopy Sciences | #62534-10 | Mold for OCT embedding |
| Buffers and Reagents | Company | Catalog Number | Comments |
| Blocking solution | 2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer. | ||
| Gelvatol (anti-fading mounting media) | Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops). Store in amber drop bottle at 4°C (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh at 1 ug/mL (1x) |
| Isopentane, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| Paraformaldehyde (PFA) in PBS | Electron Microscopy Sciences | #15710 | Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark. |
| Permeabilization solution | PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3. Prepare fresh. | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4. Prepared from 10x stock |
| Sucrose solutions | Fisher Scientific | #S-5-500 | Dissolve the appropriate amount of sucrose in 37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C. |
| Tissue-Tek OCT-compound | Sakura | #4583 | |
| Antibodies | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-calbindin | Sigma-Aldrich | C8666 | To label horinzotal cells |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | To label GABAergic amacrine cells |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | To label Müller cells |
| anti-rhodopsin | Millipore | MAB5316 | To label rods |
Referências
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- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
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