Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

Summary

Interaktioner af transkriptionsfaktorer (TFS) med RNA-polymerase er normalt undersøgt ved hjælp af rulle assays. Vi anvender en biolayer interferometri (bli) teknologi til at karakterisere samspillet mellem GRGA med Chlamydia RNA polymerase. Sammenlignet med rulle assays, registrerer bli real-time Association og dissociation, giver højere følsomhed, og er meget kvantitativ.

Abstract

En transkriptionsfaktor (TF) er et protein, der regulerer genekspression ved at interagere med RNA-polymerase, en anden TF og/eller skabelon-DNA. GRGA er en roman transskription aktivator findes specifikt i forpligte intracellulære bakterielle patogen klamydia. Protein rulle assays ved hjælp af affinitets perler har afsløret, at GRGA binder to σ-faktorer, nemlig σ⁶⁶ og σ²⁸, som genkender forskellige sæt af promotorer for gener, hvis produkter differentielt kræves på udviklingsmæssige stadier. Vi har brugt BLI til at bekræfte og yderligere karakterisere samspillet. BLI demonstrerer flere fordele i forhold til rulle: 1) det afslører real-time Association og dissociation mellem bindende partnere, 2) det genererer kvantitative kinetiske parametre, og 3) det kan detektere bindinger, som rulle assays ofte undlader at opdage. Disse egenskaber har gjort det muligt for os at udlede de fysiologiske roller af GrgA i forordningen om genekspression i klamydiaog mulige detaljerede interaktions mekanismer. Vi forestiller mig, at denne relativt overkommelige teknologi kan være yderst nyttig til at studere transskription og andre biologiske processer.

Introduction

Transskription, som producerer RNA-molekyler ved hjælp af DNA som skabelon, er det allerførste trin i genekspression. Bakteriel RNA syntese begynder efter binding af RNA polymerase (rnap) holoenzym til en Target Promoter^1,2. Det RNAP holoenzym (RNAPholo) består af en multi-subunit katalytisk kerne (RNAPcore) og en σ faktor, som er nødvendig for at genkende arrangøren sekvens. Transskriptions aktivatorer og repressorer, kollektivt betegnet TFs, regulerer genekspression gennem bindings komponenterne i RNAPcore, σ-faktorerne og/eller DNA. Afhængig af organismen, en betydelig del af dens genom kan afsættes til TFs, der regulerer transkriptionen som reaktion på fysiologiske behov og miljømæssige signaler³.

Klamydia er en forpligte intracellulær bakterie, der er ansvarlig for en række sygdomme hos mennesker og dyr^4,5,6,7,8. For eksempel, Chlamydia trachomatis er formentlig den nummer et seksuelt overført patogen hos mennesker over hele verden, og en førende årsag til blindhed i nogle underudviklede lande^4,5. Klamydia har en unik udviklingsmæssige cyklus karakteriseret ved to vekslende cellulære former kaldes den elementære krop (EB) og reticulate krop (RB)⁹. Der henviser til, at EBs er i stand til at overleve i et ekstracellulært miljø, men at det er ude af stand til spredning. EBs indtaster værtsceller gennem endokytose og skelner i større RBs i en vakuole i værts cytoplasmaet inden for timer efter inokulation. Ikke længere smitsomt, RBs prolifererer gennem binær fission. Omkring 20 timer begynder de at skelne tilbage til EBs, som forlader værtscellerne omkring 30-70 h.

Progression af Chlamydia udviklingsmæssige cyklus reguleres af transkriptionen. Der henviser til, at et over flertal af de næsten 1.000 klamydial gener udtrykkes under den midt cyklus, hvor RBs aktivt replikaerer, men at kun et lille antal gener transskriberes umiddelbart efter, at EBs er indsat i værtscellerne for at påbegynde omdannelsen af EBs i RBs, og et andet lille sæt af gener er transskriberet eller i stigende grad transskriberet til at muliggøre differentiering af RBs i EBs^10,11.

Chlamydia-genomet koder tre σ-faktorer, nemlig σ⁶⁶, σ²⁸ og σ⁵⁴. σ⁶⁶, som svarer til husholdning σ⁷⁰ af E. coli og andre bakterier, er ansvarlig for at anerkende initiativtagere til tidlige og midt-cyklus gener samt nogle sene gener, hvorimod σ²⁸ og σ⁵⁴ er nødvendige for transkriptionen af visse sene gener. Flere gener er kendt for at bære både en σ⁶⁶-afhængig promotor og en σ²⁸-afhængig promotor¹².

På trods af en kompliceret udviklingscyklus er der kun fundet et lille antal TFs i Chlamydiae¹³. GRGA (tidligere kommenteret som en hypotetisk protein CT504 i c. trachomatis blev D og CTL0766 i c. trachomatis L2) er en Chlamydia-specifikke TF oprindeligt anerkendt som en aktivator af σ⁶⁶-afhængige gener¹⁴. Affinitets rulle assays har vist, at GRGA aktiverer deres transskription ved at binde både σ⁶⁶ og DNA. Interessant nok blev det senere fundet med, at GrgA også co-udfældelse med σ²⁸, og aktiverer transskription fra σ²⁸-afhængige promotorer in vitro¹⁵. For at undersøge om GrgA har lignende eller forskellige tilhørsforhold til σ⁶⁶ og σ²⁸, tydede vi på at bruge bli. BLI assays har vist, at GrgA interagerer med σ⁶⁶ ved en 30 gange højere affinitet end med σ²⁸, hvilket tyder på, at GRGA kan spille differentialroller i σ⁶⁶-afhængig transkription og σ²⁸-afhængig transkription ¹⁵.

BLI detekterer interferens mønsteret af hvidt lys, der reflekterer fra et lag af immobiliseret protein på spidsen af en biosensor og sammenligner det med et internt reference lag¹⁶. Gennem analysen af disse to interferens mønstre kan BLI give værdifulde oplysninger i realtid om mængden af protein, som er bundet til spidsen af biosensoren. Proteinet, der er immobiliseret til spidsen af biosensoren kaldes ligand, og er generelt immobiliseret ved hjælp af en fælles antistof eller epitop tag (f. eks en poly-His-eller biotin-tag), der har en affinitet for en associeret partikel (såsom NTA eller Streptavidin) på spidsen af biosensoren. Bindingen af et sekundært protein, benævnt analysand, med ligand ved spidsen af biosensoren skaber ændringer i biosensorens opacitet og resulterer derfor i ændringer i interferens mønstre. Når BLI gentages over forskellige koncentrationer af analytten, kan den ikke blot levere kvalitative, men også kvantitative oplysninger om affiniteten mellem ligand og analysand¹⁶.

Vi var de første til at ansætte BLI til at karakterisere protein-protein interaktioner i transkriptionen¹⁵. I denne publikation viser vi, at et GrgA-fragment, der tidligere har vist sig at være nødvendigt for σ²⁸-binding, faktisk formidler bindingen. Dette manuskript fokuserer på trin i BLI-assays, og generering af BLI grafer og parametre for bindende kinetik. Metoder til fremstilling (og rensning) af ligander og analytter er ikke dækket her.

Protocol

1. fremstilling af proteiner Brug en dialysepose (med en passende cut-off-størrelse) til at dialysere hvert protein, der skal anvendes til BLI assays (herunder både hans-mærkede ligand og analysand) mod 1.000 bind af BLI buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, forkølet til 4 °C) ved 4 °C i 4 timer.Bemærk: BLI-assays kræver, at ligand er til stede ved koncentrationer, der mægle bindings stederne på biosensoren og analytten, så de er meget rens…

Representative Results

Gennem BLI assays har vi tidligere fastslået, at binding af GrgA til σ28 er afhængig af en 28 aminosyre middelregion (rester 138-165) af GRGA15. Sammenlignet med N-terminalt hans-Tagged fuld længde GrgA (NH-GrgA), en GrgA sletning konstruktion mangler denne region (NH-GrgAΔ 138-165) havde en nedsat Association rate og en øget dissociation sats, hvilket førte til en 3.000.000-fold tab af samlede affinitet (tabel 1). Her viser vi, at denne midterste region binder ?…

Discussion

Protein-protein interaktioner er afgørende for reguleringen af transkriptionen og andre biologiske processer. De er mest almindeligt undersøgt gennem rulle assays. Selv om rulle assays er relativt let at udføre, de er dårligt kvantitative og kan undlade at opdage svage, men biologisk meningsfulde interaktioner. Til sammenligning, ved at registrere real-time Association og dissociation mellem en ligand og en analysand, giver BLI sammenslutning og dissociation rate konstanter, samt, samlede affinitet.

<p class="jov…

Materials

BLItz machine	ForteBio	45-5000
Dialysis tubing cellulose membrane	MilliporeSigma	D9652
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray	ForteBio	18-5101	Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins
Drop holder	ForteBio	45-5004
PCR tubes (0.2 mL)	Thomas Scientific	CLS6571
Microcentrifuge tubes (black)	Thermo Fisher Scientific	03-391-166
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	06-666A
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
EDTA	MilliporeSigma	E6758
MgCl2	MilliporeSigma	M8266
NaCl	MilliporeSigma	S9888
Tris-HCl	GoldBio	T095100