Interaktioner af transkriptionsfaktorer (TFS) med RNA-polymerase er normalt undersøgt ved hjælp af rulle assays. Vi anvender en biolayer interferometri (bli) teknologi til at karakterisere samspillet mellem GRGA med Chlamydia RNA polymerase. Sammenlignet med rulle assays, registrerer bli real-time Association og dissociation, giver højere følsomhed, og er meget kvantitativ.
En transkriptionsfaktor (TF) er et protein, der regulerer genekspression ved at interagere med RNA-polymerase, en anden TF og/eller skabelon-DNA. GRGA er en roman transskription aktivator findes specifikt i forpligte intracellulære bakterielle patogen klamydia. Protein rulle assays ved hjælp af affinitets perler har afsløret, at GRGA binder to σ-faktorer, nemlig σ66 og σ28, som genkender forskellige sæt af promotorer for gener, hvis produkter differentielt kræves på udviklingsmæssige stadier. Vi har brugt BLI til at bekræfte og yderligere karakterisere samspillet. BLI demonstrerer flere fordele i forhold til rulle: 1) det afslører real-time Association og dissociation mellem bindende partnere, 2) det genererer kvantitative kinetiske parametre, og 3) det kan detektere bindinger, som rulle assays ofte undlader at opdage. Disse egenskaber har gjort det muligt for os at udlede de fysiologiske roller af GrgA i forordningen om genekspression i klamydiaog mulige detaljerede interaktions mekanismer. Vi forestiller mig, at denne relativt overkommelige teknologi kan være yderst nyttig til at studere transskription og andre biologiske processer.
Transskription, som producerer RNA-molekyler ved hjælp af DNA som skabelon, er det allerførste trin i genekspression. Bakteriel RNA syntese begynder efter binding af RNA polymerase (rnap) holoenzym til en Target Promoter1,2. Det RNAP holoenzym (RNAPholo) består af en multi-subunit katalytisk kerne (RNAPcore) og en σ faktor, som er nødvendig for at genkende arrangøren sekvens. Transskriptions aktivatorer og repressorer, kollektivt betegnet TFs, regulerer genekspression gennem bindings komponenterne i RNAPcore, σ-faktorerne og/eller DNA. Afhængig af organismen, en betydelig del af dens genom kan afsættes til TFs, der regulerer transkriptionen som reaktion på fysiologiske behov og miljømæssige signaler3.
Klamydia er en forpligte intracellulær bakterie, der er ansvarlig for en række sygdomme hos mennesker og dyr4,5,6,7,8. For eksempel, Chlamydia trachomatis er formentlig den nummer et seksuelt overført patogen hos mennesker over hele verden, og en førende årsag til blindhed i nogle underudviklede lande4,5. Klamydia har en unik udviklingsmæssige cyklus karakteriseret ved to vekslende cellulære former kaldes den elementære krop (EB) og reticulate krop (RB)9. Der henviser til, at EBs er i stand til at overleve i et ekstracellulært miljø, men at det er ude af stand til spredning. EBs indtaster værtsceller gennem endokytose og skelner i større RBs i en vakuole i værts cytoplasmaet inden for timer efter inokulation. Ikke længere smitsomt, RBs prolifererer gennem binær fission. Omkring 20 timer begynder de at skelne tilbage til EBs, som forlader værtscellerne omkring 30-70 h.
Progression af Chlamydia udviklingsmæssige cyklus reguleres af transkriptionen. Der henviser til, at et over flertal af de næsten 1.000 klamydial gener udtrykkes under den midt cyklus, hvor RBs aktivt replikaerer, men at kun et lille antal gener transskriberes umiddelbart efter, at EBs er indsat i værtscellerne for at påbegynde omdannelsen af EBs i RBs, og et andet lille sæt af gener er transskriberet eller i stigende grad transskriberet til at muliggøre differentiering af RBs i EBs10,11.
Chlamydia-genomet koder tre σ-faktorer, nemlig σ66, σ28 og σ54. σ66, som svarer til husholdning σ70 af E. coli og andre bakterier, er ansvarlig for at anerkende initiativtagere til tidlige og midt-cyklus gener samt nogle sene gener, hvorimod σ28 og σ54 er nødvendige for transkriptionen af visse sene gener. Flere gener er kendt for at bære både en σ66-afhængig promotor og en σ28-afhængig promotor12.
På trods af en kompliceret udviklingscyklus er der kun fundet et lille antal TFs i Chlamydiae13. GRGA (tidligere kommenteret som en hypotetisk protein CT504 i c. trachomatis blev D og CTL0766 i c. trachomatis L2) er en Chlamydia-specifikke TF oprindeligt anerkendt som en aktivator af σ66-afhængige gener14. Affinitets rulle assays har vist, at GRGA aktiverer deres transskription ved at binde både σ66 og DNA. Interessant nok blev det senere fundet med, at GrgA også co-udfældelse med σ28, og aktiverer transskription fra σ28-afhængige promotorer in vitro15. For at undersøge om GrgA har lignende eller forskellige tilhørsforhold til σ66 og σ28, tydede vi på at bruge bli. BLI assays har vist, at GrgA interagerer med σ66 ved en 30 gange højere affinitet end med σ28, hvilket tyder på, at GRGA kan spille differentialroller i σ66-afhængig transkription og σ28-afhængig transkription 15.
BLI detekterer interferens mønsteret af hvidt lys, der reflekterer fra et lag af immobiliseret protein på spidsen af en biosensor og sammenligner det med et internt reference lag16. Gennem analysen af disse to interferens mønstre kan BLI give værdifulde oplysninger i realtid om mængden af protein, som er bundet til spidsen af biosensoren. Proteinet, der er immobiliseret til spidsen af biosensoren kaldes ligand, og er generelt immobiliseret ved hjælp af en fælles antistof eller epitop tag (f. eks en poly-His-eller biotin-tag), der har en affinitet for en associeret partikel (såsom NTA eller Streptavidin) på spidsen af biosensoren. Bindingen af et sekundært protein, benævnt analysand, med ligand ved spidsen af biosensoren skaber ændringer i biosensorens opacitet og resulterer derfor i ændringer i interferens mønstre. Når BLI gentages over forskellige koncentrationer af analytten, kan den ikke blot levere kvalitative, men også kvantitative oplysninger om affiniteten mellem ligand og analysand16.
Vi var de første til at ansætte BLI til at karakterisere protein-protein interaktioner i transkriptionen15. I denne publikation viser vi, at et GrgA-fragment, der tidligere har vist sig at være nødvendigt for σ28-binding, faktisk formidler bindingen. Dette manuskript fokuserer på trin i BLI-assays, og generering af BLI grafer og parametre for bindende kinetik. Metoder til fremstilling (og rensning) af ligander og analytter er ikke dækket her.
Protein-protein interaktioner er afgørende for reguleringen af transkriptionen og andre biologiske processer. De er mest almindeligt undersøgt gennem rulle assays. Selv om rulle assays er relativt let at udføre, de er dårligt kvantitative og kan undlade at opdage svage, men biologisk meningsfulde interaktioner. Til sammenligning, ved at registrere real-time Association og dissociation mellem en ligand og en analysand, giver BLI sammenslutning og dissociation rate konstanter, samt, samlede affinitet.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed (Grants # AI122034 og AI140167) og New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
Tris-HCl | GoldBio | T095100 |