יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול
Summary
אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.
Abstract
שעתוק מקדם (TF) הוא חלבון המסדיר ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם RNA פולימראז, אחר TF, ו/או DNA תבנית. GrgA הוא שעתוק הרומן activator נמצא במיוחד ב כלמידיה הפתוגן בקטריאלי תאיים . חלבון מתגלה באמצעות חרוזי אהדה חשפו כי GrgA נקשר שני גורמים σ, כלומר σ66 ו σ28, אשר מזהים קבוצות שונות של היזמים עבור גנים שהמוצרים שלהם נדרשים בשלבים התפתחותיים. השתמשנו בלי לאשר ולאפיין עוד את האינטראקציות. בלי מראה מספר יתרונות על פני הנפתח: 1) הוא חושף שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין שותפי איגוד, 2) הוא מייצר פרמטרים קינטי כמותיים, ו 3) זה יכול לזהות איגודי כי לעתים קרובות נכשל לזהות. מאפיינים אלה אפשרו לנו להסיק את התפקידים הפיזיולוגיים של GrgA ברגולציה ביטוי גנטי בכלמידיה, ומנגנוני אינטראקציה מפורטים אפשריים. אנו מסוגלים לדמיין כי הטכנולוגיה הזולה יחסית יכולה להועיל מאוד ללימוד תמלול ותהליכים ביולוגיים אחרים.
Introduction
תמלול, אשר מייצרת מולקולות RNA באמצעות דנ א כתבנית, הוא השלב הראשון של ביטוי הגנים. סינתזה rna חיידקי מתחיל בעקבות איגוד של rna פולימראז (rnap) הולואנזים מיזם היעד1,2. ההאנזים RNAP (RNAPholo) מורכב הליבה קטליטי רב subunit (RNAPcore) וגורם σ, אשר נדרש לזיהוי רצף היזם. שעתוק מפעילים וrepressors, כינה באופן קולקטיבי TFs, לווסת את ביטוי הגנים באמצעות רכיבי הכריכה של RNAPcore, σ גורמים, ו/או DNA. בהתאם האורגניזם, חלק משמעותי של הגנום שלה עשוי להיות מוקדש TFs המסדירים תמלול בתגובה לצרכים פיסיולוגיים ורמזים סביבתיים3.
כלמידיה היא חיידק מחייב תאיים האחראי על מגוון מחלות בבני אדם ובעלי חיים4,5,6,7,8. לדוגמה, כלמידיה trachomatis היא ללא ספק הפתוגן מספר אחד המועבר באופן מיני בבני אדם ברחבי העולם, והגורם המוביל של עיוורון במספר מדינות לא מפותחות4,5. לכלמידיה יש מחזור התפתחותי ייחודי המאופיין בשני טפסים סלולאריים מתחלפים הנקראת הגוף היסודי (EB) והגוף הפורש (RB)9. בעוד, בס מסוגלים לשרוד בסביבה מתוך מסחטות, הם אינם מסוגלים לשגשוג. בס להזין תאים מארחים באמצעות האנדוציטוזה ולהבדיל ל-RBs גדול יותר בתוך ולבן בציטופלסמה המארח בתוך שעות שלאחר החיסון. כבר לא מדבקת, ה-RBs מתרבים באמצעות ביקוע בינארי. בסביבות 20 h, הם מתחילים להבדיל בחזרה ל-בס, אשר יוצאים מתאי המארח סביב 30-70 h.
ההתקדמות של המחזור ההתפתחותי לא מוסדר על ידי תמלול. ואילו מרבית הגנים הלא כמעט 1,000 מבוטאים במהלך מחזור האמצע שבמהלכו משכפלים את ה-RBs באופן פעיל, רק מספר קטן של גנים מועתק מיד לאחר כניסת בס לתאי המחשב המארח כדי ליזום את ההמרה של בס לתוך ה-RBs, ועוד קבוצה קטנה של גנים משועתק או יותר ויותר משועתק כדי לאפשר את הבידול של ה-RBs לתוך הבס10,11.
הגנום לא מקודד שלושה גורמים σ, כלומר σ66, σ28 ו σ54. σ66, אשר שווה ערך למשק הבית σ70 של E. coli וחיידקים אחרים, הוא אחראי לזיהוי היזמים של מוקדם באמצע מחזור גנים, כמו גם כמה גנים מאוחרים, בעוד σ28 ו σ54 נדרשים עבור שעתוק הגנים המאוחרים מסוימים. כמה גנים ידועים לשאת הן מקדם σ66התלוי ומקדם σ28התלוי.
למרות מחזור התפתחותי מסובך, רק מספר קטן של TFs נמצאו ב chlamydiae13. GrgA (בעבר מסומן כחלבון היפותטי CT504 ב c. trachomatis serovar D ו CTL0766 בתוך c. trachomatis L2 ) הוא TF כלמידיה ספציפי מזוהה בתחילה כactivator של σ66-גנים תלויים14. אהדה הנפתח בחני הוכיחו כי grga מפעיל את תמלול שלהם על ידי קשירה הן σ66 ו-DNA. מעניין, מאוחר יותר נמצא עם זה GrgA גם מדגיש עם σ28, ומפעיל תמלול מ σ28-היזמים תלויי מבחנה15. כדי לחקור אם GrgA יש האפידוקשרים דומים או שונים עבור σ66 ו-σ28, אנו נקטו להשתמש בלי. בלי לספר הראו כי GrgA אינטראקציה עם σ66 בזיקה גבוה 30-קיפול יותר מאשר עם σ28, הרומז כי grga עשוי לשחק תפקידים דיפרנציאליות σ66-תלוי שעתוק ו σ28-שעתוק תלוי . חמש עשרה
בלי מזהה את תבנית ההפרעה של אור לבן המשקף מתוך שכבה של כריכת שכבות חלבון על קצה של ביוסנסור ומשווה אותו לזה של שכבת התייחסות פנימית16. באמצעות ניתוח של שתי דפוסי הפרעה אלה, לא ניתן לספק מידע חשוב ובזמן אמת על כמות החלבון המאוגד לקצה הביוסנסור. החלבון שאינו מתואם לקצה הביו-חיישן מכונה הליגים, והוא בדרך כלל מקובל בעזרת נוגדן משותף או תג אפיפי (לדוגמה, פולי-או ביוטין-תג) שיש לו זיקה לחלקיק משויך (כגון נ. ת. ע או Streptavidin) על קצה הביוסנסור. הכריכה של חלבון משני, המכונה האנליטה, עם הליגובקצה הביוסנסור יוצרת שינויים באטימות הביוסנסור ולכן גורמת לשינויים בדפוסי ההפרעות. כאשר חוזר על ריכוזים שונים של האנליטה, בלי לספק מידע איכותי אך גם כמותי על הזיקה בין ליגל ואנליטה16.
למיטב ידיעתנו, אנחנו היינו הראשונים להעסיק בלי לאפיין את האינטראקציות חלבון חלבון בתמלול15. בפרסום זה, אנו מדגימים כי רסיס GrgA, אשר הוצגה בעבר כדי להיות נדרש עבור σ28-כריכה, אכן מדיה הכריכה. כתב היד הזה מתמקד בצעדים של “בלי הוראות”, וביצירת גרפים ופרמטרים של הקינטיקה המחייבים. שיטות הייצור (וטיהור) של ליגטים ומנתחי מוצרים אינם מכוסים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינטראקציות חלבונים בחלבון הן חיוניות להסדרת התמלול ולתהליכים ביולוגיים אחרים. הם למדו בדרך כלל באמצעות מוסר. למרות מוסר היורד קל יחסית לבצע, הם כמותיים גרוע ועלול להיכשל לזהות משמעות חלשה אך ביולוגית אינטראקציות. לעומת זאת, על ידי גילוי שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין ליגט לבין האנליטה, מ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (מענקים AI122034 ו AI140167) ו ניו ג’רזי קרן הבריאות (גרנט PC 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
Referências
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
