Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição
Summary
As interações de fatores de transcrição (TFs) com a RNA polimerase são geralmente estudadas usando ensaios de pulldown. Nós aplicamos uma tecnologia da interferometria de Biolayer (BLI) para caracterizar a interação de GrgA com o polymerase do RNA do chlamydial. Comparado aos ensaios de pulldown, o BLI detecta associação e dissociação em tempo real, oferece maior sensibilidade e é altamente quantitativo.
Abstract
Um fator de transcrição (TF) é uma proteína que regula a expressão gênica interagindo com o RNA polimerase, outro TF, e/ou DNA do modelo. O GrgA é um ativador de transcrição inovador encontrado especificamente no patógeno bacteriano intracelular obrigatório clamídia. Os ensaios de pulldown da proteína que usam grânulos da afinidade revelaram que GrgA liga dois fatores do σ, a saber σ66 e σ28, que reconhecem jogos diferentes dos promotores para os genes cujos os produtos são exigidos diferencialmente em estágios desenvolventes. Nós usamos BLI para confirmar e caracterizar mais as interações. BLI demonstra várias vantagens sobre pulldown: 1) revela associação em tempo real e dissociação entre parceiros vinculativos, 2) gera parâmetros cinéticos quantitativos e 3) ele pode detectar ligações que os ensaios de pulldown muitas vezes não conseguem detectar. Estas características permitiram-nos deduzir os papéis fisiológicos de GrgA na regulação da expressão gênica na clamídia, e possíveis mecanismos detalhados de interação. Nós imaginamos que esta tecnologia relativamente acessível pode ser extremamente útil para estudar a transcrição e outros processos biológicos.
Introduction
A transcrição, que produz moléculas de RNA usando DNA como modelo, é o primeiro passo da expressão gênica. A síntese de RNA bacteriano começa após a ligação da holoenzima RNA polimerase (RNAP) a um promotor-alvo1,2. O holoenzyme de RNAP (RNAPholo) é compreendido de um núcleo catalítico do multi-subunit (RNAPcore) e de um fator σ, que seja exigido para reconhecer a seqüência do promotor. Ativadores de transcrição e repressores, coletivamente denominados TFs, regulam a expressão gênica através dos componentes de ligação do RNAPcore, σ fatores e/ou DNA. Dependendo do organismo, uma parcela significativa do seu genoma pode ser dedicada a TFs que regulam a transcrição em resposta às necessidades fisiológicas e sugestões ambientais3.
A clamídia é uma bactéria intracelular obrigatória responsável por uma variedade de doenças em humanos e animais4,5,6,7,8. Por exemplo, Chlamydia trachomatis é indiscutivelmente o número um patógeno sexualmente transmitido em humanos em todo o mundo, e uma das principais causas de cegueira em alguns países subdesenvolvidos4,5. A clamídia tem um ciclo de desenvolvimento único caracterizado por duas formas celulares alternadas denominadas de corpo elementar (EB) e corpo RETICULADO (RB)9. Considerando que, os EBs são capazes de sobreviver em um ambiente extracelular, eles são incapazes de proliferação. EBs entrar células hospedeiras através de endocitose e diferenciar em maior RBs em um vacuol no citoplasma hospedeiro dentro de horas após a inoculação. Não mais infeccioso, RBs proliferam através de fissão binária. Ao redor 20 h, começam diferenciar-se de volta ao EBs, que saem das pilhas do anfitrião ao redor 30-70 h.
A progressão do ciclo de desenvolvimento de clamídia é regulada pela transcrição. Visto que uma supermaioria dos quase 1.000 genes chlamydial é expressada durante o midcycle durante que RBs está replicando ativamente, somente um número pequeno de genes é transcrito imediatamente depois que a entrada de EBs nas pilhas do anfitrião para iniciar a conversão de EBs em RBs, e outro pequeno conjunto de genes são transcritos ou cada vez mais transcritos para permitir a diferenciação de RBs em EBs10,11.
O genoma da clamídia codifica três fatores σ, ou seja, σ66, σ28 e σ54. σ66, que é equivalente ao housekeeping σ70 de e . coli e outras bactérias, é responsável para reconhecer promotores de genes adiantados e meados de-ciclo assim como alguns genes atrasados, visto que σ28 e σ54 são exigidos para a transcrição de certos genes tardios. Vários genes são conhecidos por transportar um promotor σ66-dependente e um promotor σ28-dependente12.
Apesar de um ciclo de desenvolvimento complicado, apenas um pequeno número de TFs foi encontrado em Chlamydiae13. Grga (anotado previamente como uma proteína hipotética CT504 em c. trachomatis sorovar D e em CTL0766 em c. trachomatis L2) é um TF Chlamydia-específico reconhecido inicialmente como um activador de σ66-dependente genes14. Os ensaios de pulldown da afinidade demonstraram que GrgA ativa sua transcrição ligando σ66 e ADN. Curiosamente, foi mais tarde encontrado com que GrgA também coprecipitates com σ28, e ativa a transcrição de σ28promotores dependentes in vitro15. Para investigar se GrgA tem afinidades similares ou diferentes para σ66 e σ28, nós recorramos a usar o bli. Os ensaios de BLI mostraram que o GrgA interage com σ66 em uma afinidade 30-fold mais elevada do que com σ28, sugerindo que Grga possa jogar papéis diferenciais em σ66-dependente transcrição e σ28-transcrição dependente quinze anos.
A BLI detecta o padrão de interferência da luz branca que reflete a partir de uma camada de proteína imobilizada na ponta de um biosensor e a compara à de uma camada de referência interna16. Através da análise destes dois padrões de interferência, a BLI pode fornecer informações valiosas e em tempo real sobre a quantidade de proteínas ligadas à ponta do biosensor. A proteína que é imobilizada à ponta do biosensor é referida como o ligand, e é imobilizada geralmente com a ajuda de um anticorpo comum ou de um Tag do epítopo (por exemplo, um poli-his-ou a biotina-etiqueta) que tem uma afinidade para uma partícula associada (tal como NTA ou Streptavidin) na ponta do biosensor. O emperramento de uma proteína secundária, referida como o analyte, com o ligante na ponta do biosensor cria mudanças na opacidade do biosensor e conseqüentemente conduz às mudanças em testes padrões da interferência. Quando repetida em diferentes concentrações do analito, a BLI pode fornecer não apenas informações qualitativas, mas também quantitativas, sobre a afinidade entre o ligantes e o analito16.
Ao melhor de nosso conhecimento, fomos os primeiros a empregar a BLI para caracterizar as interações proteína-proteína na transcrição15. Nesta publicação, demonstramos que um fragmento Grga, que foi anteriormente mostrado para ser exigido para σ28-Binding, realmente Medeia a ligação. Este manuscrito centra-se nas etapas dos ensaios de BLI, e na geração de gráficos de BLI e em parâmetros da cinética obrigatória. Métodos para a produção (e purificação) de ligantes e analitos não são cobertos aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
As interações proteína-proteína são cruciais para a regulação da transcrição e outros processos biológicos. Eles são mais comumente estudados através de ensaios de pulldown. Embora os ensaios de pulldown sejam relativamente fáceis de executar, eles são pouco quantitativos e podem não detectar interações fracas, mas biologicamente significativas. Em comparação, detectando associação e dissociação em tempo real entre um ligantes e um analito, o BLI fornece constantes de taxa de associação e dissoci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (Grants # AI122034 e AI140167) e pela New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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