Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции
Summary
Взаимодействие транскрипционных факторов (TFs) с РНК-полимеразой обычно изучается с помощью анализов свау. Мы применяем технологию биослойной интерферометрии (BLI) для характеристики взаимодействия GrgA с хламидиальной РНК-полимеразой. По сравнению с анализами стягивания, BLI обнаруживает ассоциацию и диссоциацию в реальном времени, обеспечивает более высокую чувствительность и является высокой количественной.
Abstract
Фактор транскрипции (TF) является белок, который регулирует экспрессию генов, взаимодействуя с РНК-полимераза, другой TF, и / или шаблон ДНК. GrgA является новым активатором транскрипции, найденным специально в облике внутриклеточного бактериального патогена Хламидиоз. Белковые анализы с использованием бисера сродства показали, что GrgA связывает два фактора, а именно:66 и28,которые распознают различные наборы промоутеров для генов, продукты которых по-разному необходимы на стадиях развития. Мы использовали BLI для подтверждения и дальнейшей характеристики взаимодействий. BLI демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с выдвижной: 1) Он показывает в режиме реального времени ассоциации и диссоциации между обязательными партнерами, 2) Он генерирует количественные кинетические параметры, и 3) Он может обнаружить привязки, что выдвижной анализы часто не обнаруживаются. Эти характеристики позволили нам вывести физиологические роли GrgA в регуляции экспрессии генов в хламидиозе,и возможные подробные механизмы взаимодействия. Мы представляем, что эта относительно доступная технология может быть чрезвычайно полезна для изучения транскрипции и других биологических процессов.
Introduction
Транскрипция, которая производит молекулы РНК с использованием ДНК в качестве шаблона, является самым первым шагом экспрессии генов. Бактериальный синтез РНК начинается после связывания РНК-полимераза(RNAP) голефермента к целевому промоутеру 1,2. Голензим RNAP (RNAPholo) состоит из многосубунитая каталитического ядра (РНАПкор) и коэффициента, который необходим для распознавания последовательности промотора. Активаторы и репрессоры транскрипции, которые в совокупности называются TFs, регулируют экспрессию генов через связывающие компоненты РНАПКОР, факторы и/или ДНК. В зависимости от организма, значительная часть его генома может быть посвящена TFs, которые регулируют транскрипцию в ответ на физиологические потребности и экологические сигналы3.
Хламидиоз является обликовой внутриклеточной бактерией, ответственной заразличные заболевания у людей и животных 4,5,6,7. Например, Chlamydia trachomatis, возможно, номер один венерических патогенов в организме человека во всем мире, и ведущей причиной слепоты в некоторых слаборазвитых странах4,5. Хламидиоз имеет уникальный цикл развития, характеризующийся двумя чередующимися клеточными формами, терминированными элементарным телом (EB) и ретикулированным телом (RB)9. В то время как ЭБ способны выжить во внеклеточной среде, они неспособны к распространению. EBs ввести клетки хозяина через эндоцитоз и дифференцировать в более большие RBs в vacuole в цитоплазме хозяина в течение нескольких часов после прививки. Больше не заразны, RBs размножаться через двоичные деления. Около 20 ч, они начинают дифференцировать обратно к EBs, которые выходят из клеток-хозяев около 30-70 ч.
Прогрессирование цикла развития хламидийного регулируется транскрипцией. В то время как супербольшинство из почти 1000 генов хламидийных выражены во время среднего цикла, во время которого РБ активно реплицируются, только небольшое количество генов транскрибируются сразу после вступления EBs в клетки-хозяина, чтобы инициировать преобразование EBs в RBs, и другой небольшой набор генов транскрибируются или все чаще транскрибируются, чтобы дифференциация РБ в EBs10,11.
Геном хламидийного кода кодирует три фактора, а именно:66,28 и54. 66 , что эквивалентно ведению домашнего хозяйстваNo 70 кишечной палочки и других бактерий, отвечает за распознавание промоторов генов раннего и среднего цикла, а также некоторых поздних генов, в то время как для распознавания генов раннего и среднего цикла требуется28 и54 евро транскрипция некоторых поздних генов. Несколько генов, какизвестно, несут как No 66-зависимых промоутер и No 28-зависимых промоутер12.
Несмотря на сложный цикл развития, лишь небольшое количество TFs были найдены в хламидиоза13. GrgA (ранее аннотированный как гипотетический белок CT504 в C. trachomatis serovar D и CTL0766 в C. trachomatis L2) является Chlamydia-специфическимTF, первоначально признанным активатором генов No 66-зависимых14. Аффинити вытягивания анализы показали, что GrgA активирует их транскрипции, связывая какNo 66 и ДНК. Интересно, что позже было найдено с тем, что GrgA также совместно осаждает с28, и активирует транскрипцию от 28-зависимых промоутеров in vitro15. Чтобы исследовать, имеет ли GrgA сходные или различные сходства дляNo 66 иNo 28,мы прибегли к использованию BLI. BLI анализы показали, что GrgA взаимодействует сNo 66 в 30-кратном более высоком сродстве, чем с28,предполагая, что GrgA может играть дифференцированные роли в 66-зависимой транскрипции и28-зависимойтранскрипции 15.
BLI обнаруживает интерференционную модель белого света, которая отражается от слоя обездвиженого белка на кончике биосенсора, и сравнивает его с внутренним эталонным слоем16. Благодаря анализу этих двух интерференционных моделей, BLI может предоставить ценную и в режиме реального времени информацию о количестве белка, привязанного к кончику биосенсора. Белок, который обездвижен к кончику биосенсора, называется лигандом и, как правило, обездвижен с помощью общего антитела или эпитопа (например, поли-Его- или биотин-тег), который имеет сродство к ассоциированной частицы (например, NTA или Стрептавидин) на кончике биосенсора. Связывание вторичного белка, называемого анализным, с лигандой на кончике биосенсора создает изменения в непрозрачности биосенсора и, следовательно, приводит к изменениям в интерференционных моделях. При повторении в течение различных концентраций аналита, BLI может предоставить не только качественную, но и количественную информацию о сродстве между лигандом и аналитом16.
Насколько нам известно, мы были первыми, кто использовал BLI для характеристики белково-белковых взаимодействий в транскрипции15. В этой публикации мы демонстрируем, что фрагмент GrgA,который ранее был показан как необходимый для 28-связной, действительно опосредует привязку. Данная рукопись посвящена шагам анализов BLI, а также генерации графиков BLI и параметров связывающей кинетики. Методы производства (и очистки) лигандов и аналитов здесь не охватываются.
Protocol
Representative Results
Discussion
Белково-белковые взаимодействия имеют решающее значение для регуляции транскрипции и других биологических процессов. Они наиболее часто изучаются с помощью анализов свайпов. Хотя анализы вытягивания относительно легки для выполнения, они плохо количественные и могут не обнаружить с…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (Гранты AI122034 и AI140167) и Фондом здравоохранения Нью-Джерси (Грант 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
Referências
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
