Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription
Summary
Interaktioner av transkriptionsfaktorer (TFs) med RNA-polymeras studeras vanligtvis med PULLDOWN-analyser. Vi tillämpar en teknik för Biolayer interferometri (BLI) för att karakterisera interaktionen mellan GrgA och klamydial RNA-polymeras. Jämfört med PULLDOWN-analyser upptäcker BLI realtids Association och dissociation, ger högre känslighet och är mycket kvantitativ.
Abstract
En transkriptionsfaktor (TF) är ett protein som reglerar genuttryck genom att interagera med RNA-polymeras, en annan TF, och/eller mall-DNA. GrgA är en roman transkription Activator finns specifikt i obligate intracellulära bakteriella patogenen klamydia. Protein PULLDOWN-analyser med affinitet pärlor har avslöjat att GrgA binder två σ-faktorer, nämligen σ66 och σ28, som erkänner olika uppsättningar av promotorer för gener vars produkter differentially krävs i utvecklingsstadier. Vi har använt BLI för att bekräfta och ytterligare karakterisera samspelet. BLI visar flera fördelar jämfört med PULLDOWN: 1) det avslöjar realtid Association och dissociation mellan bindande partners, 2) Det genererar kvantitativa kinetiska parametrar, och 3) det kan upptäcka bindningar som PULLDOWN analyser ofta misslyckas med att upptäcka. Dessa egenskaper har gjort det möjligt för oss att härleda de fysiologiska rollerna för GrgA i gen uttrycks reglering i klamydia, och eventuella detaljerade interaktionsmekanismer. Vi ser att denna relativt överkomliga teknik kan vara mycket användbar för att studera transkription och andra biologiska processer.
Introduction
Transkription, som producerar RNA-molekyler som använder DNA som mall, är det första steget i genuttrycket. Bakteriell RNA-syntes börjar efter bindningen av RNA-polymeras (rnap) holoenzym till en mål promotor1,2. Den RNAP holoenzym (RNAPholo) består av en multi-subunit katalytisk kärna (RNAPcore) och en σ Factor, som krävs för att erkänna promotorn sekvensen. Transkription aktivatorer och repressorer, kollektivt kallas TFs, reglera genuttrycket genom de bindande komponenterna i RNAPcore, σ faktorer, och/eller DNA. Beroende på organismen kan en betydande del av arvsmassan ägnas åt TFs som reglerar transkription som svar på fysiologiska behov och Miljösignaler3.
Klamydia är en obligate intracellulär bakterie som ansvarar för en mängd olika sjukdomar hos människor och djur4,5,6,7,8. Till exempel är Chlamydia trachomatis utan tvekan den främsta sexuellt överförbara patogenen i människor över hela världen, och en ledande orsak till blindhet i vissa underutvecklade länder4,5. Klamydia har en unik utvecklingscykel som kännetecknas av två omväxlande cellulära former kallas den elementära kroppen (EB) och nätaktigt Body (RB)9. Medan EBs kan överleva i en extracellulär miljö, de är oförmögna att spridning. EBS ange värdceller genom endocytos och differentiera till större RBS i en vakuol i värdens cytoplasma inom några timmar efter inympning. Inte längre infektiösa, RBS föröka sig genom binär fission. Runt 20 h, börjar de att differentiera tillbaka till EBs, som lämnar värdcellerna runt 30-70 h.
Progression av klamydia utvecklingscykeln regleras genom transkription. En supermajoritet av de nästan 1 000 klamydial generna uttrycks under den midcycle under vilken RBs aktivt replikerar, men endast ett litet antal gener transkriberas omedelbart efter det att EBs har inträtt i värdcellerna för att initiera omvandlingen av EBs till RBs, och en annan liten uppsättning gener transkriberas eller alltmer transkriberas för att möjliggöra differentiering av RBs i EBs10,11.
Klamydia arvsmassan kodar för tre σ-faktorer, nämligen σ66, σ28 och σ54. σ66, som motsvarar den städ-σ70 av E. coli och andra bakterier, är ansvarig för att erkänna initiativtagarna till tidiga och medelcyklande gener samt vissa sena gener, medan σ28 och σ54 krävs för transkription av vissa sena gener. Flera gener är kända för att bära både en σ66-beroende promotor och en σ28-beroende promotor12.
Trots en komplicerad utvecklingscykel har endast ett litet antal TFs hittats i Chlamydiae13. GrgA (tidigare kommenterade som ett hypotetiskt protein CT504 i c. trachomatis serovar D och CTL0766 i c. trachomatis L2) är en KLAMYDIA-specifik TF initialt erkänd som en aktivare av σ66-beroende gener14. Affinitet PULLDOWN-analyser har visat att GrgA aktiverar sin transkription genom att binda både σ66 och DNA. Intressant, det var senare hittades med att GrgA också Co-fällates med σ28, och aktiverar transkription från σ28-beroende initiativtagare in vitro–15. För att undersöka om GrgA har liknande eller olika tillhörighet för σ66 och σ28så använder vi bli. BLI-analyser har visat att GrgA interagerar med σ66 vid en 30-faldig högre affinitet än med σ28, vilket tyder på att Grga kan spela differential roller i σ66-beroende transkription och σ28-beroende transkription 15.
BLI upptäcker interferensmönstret av vitt ljus som reflekterar från ett skikt av immobiliserat protein på spetsen av en biosensor och jämför det med en intern referensskikt16. Genom analysen av dessa två störnings mönster, kan BLI ge värdefull och realtidsinformation om mängden proteinbundet till spetsen av biosensorn. Proteinet den där er immobiliserade till spets om bio sensoren är benämn så den ligand, och är vanligvis immobiliserade med det hjälp av en gemensam kropp eller epitop tag (e.g., en poly-hans-eller biotin-tag) så pass har en affinitet för en förbundet partikel (sådan som nta eller Streptavidin) på spetsen av biosensorn. Bindningen av ett sekundärt protein, kallad analyten, med ligand vid spetsen av biosensorn skapar förändringar i bio sensorns opacitet och leder därför till förändringar i störnings mönstren. Vid upprepad över olika koncentrationer av analyten kan BLI ge inte bara kvalitativ utan även kvantitativ information om affinitet mellan ligand och analyt16.
Till det bästa av vår kunskap var vi de första att anställa BLI att karakterisera protein-protein interaktioner i transkription15. I den här publikationen visar vi att ett GrgA-fragment, som tidigare visats vara obligatoriskt för σ28-bindande, faktiskt förmedlar bindningen. Detta manuskript fokuserar på steg i BLI-analyser och generering av BLI grafer och parametrar för bindningskinetik. Metoder för produktion (och rening) av ligander och analyter täcks inte här.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-proteininteraktioner är avgörande för regleringen av transkription och andra biologiska processer. De är vanligast studeras genom PULLDOWN analyser. Även PULLDOWN analyser är relativt lätt att utföra, de är dåligt kvantitativa och kan misslyckas med att upptäcka svaga men biologiskt meningsfulla interaktioner. I jämförelse, genom att upptäcka realtid Association och dissociation mellan en ligand och en analyt, ger BLI Association och dissociation Rate konstanter, samt, övergripande tillhörighet.</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrag # AI122034 och AI140167) och New Jersey Health Foundation (Grant # PC 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
Referências
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
